洛伐他汀是从土曲霉中分离得到的一种聚酮类药物,因其底物竞争性抑制胆固醇生物合成途径中的限速酶活性而被作为降血脂药物使用。莫纳可林J是其生物合成途径中一个重要的中间代谢产物,同时也是工业上生产另一个他汀类药物——辛伐他汀的前体,洛伐他汀和辛伐他汀都是当前广泛使用的降血脂药物,具有巨大的药用和经济价值。目前洛伐他汀生产主要源于土曲霉发酵,而前体莫纳可林J则通过化学法水解洛伐他汀得到,在二者生产过程中,土曲霉发酵常面临发酵周期长、次级代谢产物背景复杂、基因水平操作相对困难等问题,而化学水解法常需要引入对环境不利的催化剂、反应条件相比生物反应条件更加苛刻。随着合成生物学发展,研究者们提出使用微生物细胞工厂进行天然次级代谢产物异源合成的概念,为解决这些问题提供了良好的思路和方法。毕赤酵母是广泛使用的重组蛋白异源表达宿主,相比原核表达系统具有成熟完备的蛋白翻译后修饰机制,相比酿酒酵母系统不存在过度糖基化,同时毕赤酵母能够在简单无机盐培养基中生长至高密度,具有广泛的碳源适用性,能够在工业原料甘油、甲醇、乙醇中高效生长代谢,且其基因操作方法成熟、有商业化的工具质粒。目前,大量异源蛋白已经在毕赤酵母中成功表达,但利用毕赤酵母异源合成小分子药用化合物的研究较少,本研究旨在毕赤酵母中重塑洛伐他汀的生物合成途径,并建立基于工业原料甲醇/乙醇底物的洛伐他汀及莫纳可林J的生产方法。(1)在毕赤酵母中引入洛伐他汀生物合成所需的异源基因,使用甲醇诱导型启动子PAOX1驱动各基因表达,构建多基因共表达质粒,在毕赤酵母中成功构建了以甲醇为底物的洛伐他汀及莫纳可林J的异源生物合成途径。在莫纳可林J合成菌株中,对lovA进行密码子优化、辅酶基因cpr共表达,提升了中间产物莫纳可林L向莫纳可林J的转化,在此基础上密码子优化lovD,促进了莫纳可林J向洛伐他汀的转化。利用高效液相色谱、质谱以及核磁鉴定了毕赤酵母工程菌株的发酵产物,确定了洛伐他汀合成途径中间体——二氢莫纳可林L、莫纳可林L和莫纳可林J;(2)对毕赤酵母洛伐他汀异源合成途径进行基因拷贝数优化,在摇瓶水平甲醇为底物的培养条件下,洛伐他汀产量达到19 mg/L。所得高拷贝菌株在5-L反应器、甲醇为底物条件下,洛伐他汀产量达到288 mg/L,相比单拷贝菌株在5-L反应器中洛伐他汀产量提升了 268%。将洛伐他汀合成途径在二氢莫纳可林L处拆分为两个模块,分别置入两个毕赤酵母细胞进行共培养,当两菌株初始接种比为1:1时,摇瓶水平发酵得到的洛伐他汀产量达到25 mg/L,相比单菌株培养的洛伐他汀产量提升了 71%。同时,在5-L反应器规模重复验证了各共培养策略的最优接种比例,其中,共培养策略B在初始接种比为1:2时,莫纳可林J的产量达到最高为594 mg/L,相比单菌株的发酵产量提升了17%;共培养策略D在初始接种比为1:1时,洛伐他汀的产量最高达到255.5 mg/L,相比单菌株的发酵产量提升了 220%;(3)为加强洛伐他汀异源合成途径的前体供应,在毕赤酵母中设计了乙醇诱导型人工转录调控遗传线路(乙醇兼具底物、诱导剂、前体等多种功能),并构建了人工转录调控信号增益器件PICL1-LM/lacO-cPAOX1,用于驱动外源基因转录表达。为验证人工转录调控系统的可行性,首先监测了毕赤酵母在各碳源条件下的生长,发现毕赤酵母在乙醇条件下的生长强于甲醇,且最终菌体密度与葡萄糖/甘油条件下几乎相同,说明毕赤酵母能够以乙醇为底物生长至高密度。其次,对乙醇代谢途径酶基因adh3,ald,acs1进行缺失,发现缺失株在乙醇条件下表现出不同程度生长受损,说明乙醇经乙醛、乙酸合成乙酰辅酶A的途径是毕赤酵母代谢乙醇的主要代谢通路,验证了乙醇作为底物和前体效应物的功能性。以荧光蛋白eGFP为报告蛋白测试人工转录系统的转录强度,发现在乙醇为单一碳源条件下,人工转录调控系统在乙醇体系的eGFP表达强度达到PAOX1启动子在甲醇体系中eGFP表达强度的2.8倍。而葡萄糖为底物时PICL1-LM/lacO-cPAOX1驱动的eGFP表达强度为乙醇为底物时的6.7%,说明通过葡萄糖/乙醇的碳源切换,人工转录调控系统能够实现阻遏/诱导外源基因表达的调控。(4)以聚酮化合物6-甲基水杨酸为报告化合物测试乙醇诱导型人工转录调控系统合成异源化合物的能力,摇瓶水平6-MSA的产量达到690 mg/L,相比PAOX1/甲醇体系的6-MSA产量提升了 305%。使用该系统构建二氢莫纳可林L的异源生产菌株,在摇瓶水平产量达到63 mg/L,相比PAOX1/甲醇体系的的二氢莫纳可林L产量提升了 184%,进一步证明了该系统合成异源化合物的能力。最后,过表达来自酿酒酵母的adh2、ald6和编码酰基化位点突变的acs1来增强乙醇合成乙酰辅酶A代谢,过表达毕赤酵母内源的acc1并突变编码蛋白的负调控位点以促进乙酰辅酶A合成丙二酰辅酶A,使二氢莫纳可林L的摇瓶发酵产量提升至185 mg/L。在此基础上,结合多细胞共培养策略,提升莫纳可林J的异源合成量至156 mg/L,在5-L反应器以乙醇为底物条件下,莫纳可林J的产量达到2.2 g/L,初步具有规模化生产的能力。