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目的:随着世界上老龄人口增多,多发于高龄人群的慢性骨髓增殖性疾病(cMPDs)也日益增多。cMPDs主要包括真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、慢性特发性骨髓纤维化(CIMF)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)、慢性嗜酸性粒细胞白血病(CEL)及不能分类者(CMPDS-U)。其中,CML的分子生物学发病机制已明确。约90%~95%CML患者Ph染色体阳性,即由位于9号染色体长臂的原癌基因ABL易位到22号染色体长臂与BCR基因相融合形成BCR/ABL融合基因。Ph染色体阳性的CML患者对伊马替尼(为cKit,PDGFR和Abl酪氨酸激酶的抑制剂)治疗反应良好。ET、PV、IMF组成了经典的BCR/ABL阴性的cMPDs,病程中以栓塞、出血为主要并发症,晚期IMF患者可出现严重的全血细胞减少。三者间可以相互转化,也可以进展为CML或急性白血病。与CML不同,在PV、ET和IMF患者没有发现可重复性染色体易位,也无特效治疗药物。
近年国外数个研究组报道发现了JAK2V617F基因突变。它广泛存在于BCR/ABL阴性的cMPDs患者中。JAK2 V617F是一种高致病性获得性基因突变,即在JAK2基因的第1849位点发生G→T突变,导致JAK2蛋白第617位的缬氨酸被苯丙氨酸代替,推测JAK2 V617F点突变所产生的激活作用是PV、ET、IMF的重要发病机制,国内未见相关报道。另一方面,KLF4 mRNA是锌指蛋白转录因子家族的一员,KLF4(旧称GKLF)在多种组织有表达,对控制造血干细胞分化有重要作用。一些研究表明:KLF4 mRNA在骨髓增殖性疾病表达增高。
但JAK2V617F点突变与KLF4 mRNA表达异常之间的的关系尚未明了,KLF4 mRNA表达水平对BCR/ABL阴性的MPD疾病发展的影响等研究尚是一项空白。本研究旨在检测JAK2基因的第617位点在PV、ET、IMF患者和CML、急性白血病以及健康个体的突变情况和KLF4 mRNA的表达情况。探讨JAK2V617F点突变和KLF4 mRNA表达水平与BCR/ABL阴性的骨髓增殖性疾病的关系,进一步揭示这组疾病的BCR/ABL分子生物学发病机制,为开发相应的靶向治疗药物提供理论依据。
方法:
1 患者为2006年2月~2006年12月期间在河北医科大学第二医院、邯郸市中心医院和衡水市哈励逊医院血液内科住院和门诊随访的病人。本实验研究设观察组62例,包括各种cMPDs患者:其中真性红细胞增多症(PV)26例、原发性血小板增多症(ET)26例、慢性特发性骨髓纤维化(CIMF)9例、慢性嗜中性粒白血病(CNL)1例,对照组包括慢性粒细胞性白血病(CML)20例、急性白血病(AL)12例和12名健康志愿者。所有病人符合WH0 2000年诊断标准,并排除了继发性红细胞增多症、继发性血小板增多症、继发性骨髓纤维化。
2 肝素抗凝留取各组病人和健康志愿者5ml骨髓或8ml外周血,提取单个核细胞放.80℃冰箱备用,集中提取各份标本的DNA和总RNA。
3 用RT-PCR技术检测BCR/ABL融合基因mRNA和KLF4mRNA的表达率和表达水平。根据BCR/ABL融合基因检测结果,把所有患者分为BCR/ABL融合基因阳性或阴性两组。
4 用AS-PCR技术检测各组JAK2 V617F点突变。根据JAK2V617F点突变阳性与否,把BCR/ABL阴性的cMPDs患者分成JAK2 V617F点突变阳性、阴性两组。
5 观察记录患者的临床资料,包括年龄、性别、临床症状、体征、血象、骨髓象、骨髓病理以及治疗反应。
6 统计学处理:采用单因素方差分析比较KLF4 mRNA在MPD组、急性白血病组、慢性粒细胞白血病组与正常对照组中的表达水平有无差异:卡方检验分析JAK2 V617F点突变率在各组的差异。JAK2 V617F基因突变阳性各组与对照组比差异采用Fisher确切概率法比较。KLF4 mRNA在PV组、ET组、IMF组各组内阳性组阴性组用t检验。JAK2 V617F基因突变阴性组与阳性组并发症的比较用秩和检验。因例数少以出现一项为1分合并后对比。例如:脾脏大、出血、血栓均出现的算3分所有数据用SPSS11.0统计软件分析处理。检验水准取α=0.05。
结果:
1 在82例骨髓增殖性疾病中,20例CML患者BCR/ABL融合基因阳性,其余62例cMPDs患者BCR/ABL融合基因阴性。12例AL患者和12位正常对照者BCR/ABL融合基因均阴性。
2 JAK2 V617F基因突变检测结果:62例BCR/ABL阴性的cMPDs患者中,共有44例患者检测到JAK2 V617F点突变,分别为9例IMF患者5例突变阳性,阳性率为55.56%,26例ET中15例突变阳性,阳性率57.69%,26例PV中有23例突变阳性,阳性率88.46%。 20例CML、12例AL患者和12位正常对照者,没有检测到JAK2 V617F基因突变。BCR/ABL融合基因阴性、阳性两组间JAK2 V617F基因突变阳性率差别有显著意义。
3 KLF4 mRNA在每例样本中均有表达。KLF4 mRNA的表达水平在PV组与其它各组间相比较,差别有显著意义,即PV组KLF4 mRNA的表达水平显著高于其他各组。F=2.354,P=0.0468。其它各组之间比无显著差别,P值都大于0.05.4 在PV、ET、IMF组,JAK2 V617F基因突变阳性组和阴性组组内比较KLF4 mRNA的表达水平差别有显著意义。
5 在JAK2 V617F基因突变阳性组和阴性组之间,仅JAK2V617F基因突变阳性的ET组的并发症明显高于阴性组,其他各组临床数据无显著差别。
结论:
1 大部分cMPDs患者存在JAK2 V617F点突变。提示JAK2V617F点突变所产生的激活作用是PV、ET、IMF的重要发病机制。
2 在PV、ET、IMF各亚组,JAK2 V617F点突变阳性组和阴性组组内比较KLF4 mRNA的表达水平有显著差异(P<0.05)。与ET组、IMF组、CML组、AL组和正常对照组相比,PV组KLF4 mIRNA的表达水平明显增高,P<0.05,统计学分析差别有显著意义。其他各组之间KLF4表达水平的差别无显著意义。
3 在BC刚ABL融合基因阴性的cMPDs各亚组中,JAK2V617F基因突变阳性率无显著差异。BCR/ABL融合基因阴性的cMPDs组JAK2 V617F基因突变阳性率与CML组、AL组、对照组之间比较,差别有显著性。CNL组1例,没做统计分析。