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猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是当前临床上导致仔猪腹泻最常见的致病性病原之一,自1971年该病被发现起,时至今日仍持续危害着整个养猪业,给我国造成了严重的经济损失。本研究为了掌握目前山东多个地区PEDV流行毒株S基因的遗传变异情况,并对PEDV疫苗株、变异株与经典株建立鉴别诊断方法,利用建立的鉴别诊断方法对临床上大批量样品进行检测鉴定。试验采用Trizol法提取病毒总RNA,针对PEDV S基因设计4对特异性引物,RT-PCR方法分段扩增S基因全序列,将本研究所获得的PEDV毒株序列与其他地区分离得到的流行株基因序列对比、分析,构建PEDV S基因遗传进化树;针对ORF3基因缺失部位与S基因的变异区域设计两对特异性引物利用双重RT-PCR技术建立鉴别诊断PEDV三种毒株的方法。试验结果显示,PEDV疑似病料的总阳性率为76.40%,同源性分析本研究获得的8株PEDV变异株,此8株变异株的S基因序列多处存在插入、缺失与变异现象,且各毒株的基因序列之间存在较大的差异,从遗传进化树上可观察到此8株变异株分别位于三个大分支上;本研究建立的双重RT-PCR方法,经过反应条件的优化,成功扩增出符合预期目的的基因片段,其大小分别为149 bp、198 bp与429 bp,可在同一RT-PCR反应体系内完成对PEDV三种毒株的鉴别,经重复性检验证明该方法较为稳定,交叉反应性检测无交叉反应现象出现,临床样品随机检测结果与单一RT-PCR检测结果一致。本研究得到以下结论,PED对山东养猪业仍存在较大的危害,通过对比发现山东地区PEDV流行株的S基因在遗传变异方面具有多样性,同源性远近不同;利用本研究建立的PEDV双重RT-PCR方法检测三种毒株并准确地对疫苗株、变异株、经典株作出判断,其中变异株占PEDV阳性毒株的77.54%,已成为山东地区猪群内PEDV的优势毒株。在日常养殖与防控工作中应最大程度的减小PED对猪群的危害,在做好必要的防疫工作的同时还要加强对PEDV三种毒株的检测与分子流行病学调查,及时掌握疫病的发展趋势,制定科学的防疫措施以保证猪群持续、健康的发展。