论文部分内容阅读
蜜蜂的寿命及抗性与蜜蜂的抗氧化能力有直接联系,生物体内活性氧（ROS）的积累能引起DNA、蛋白质等生物大分子的氧化性损伤,如甲硫氨酸被氧化而变为甲硫氨酸亚砜,可导致其所在蛋白的生物学活性降低或丧失。生物体内普遍存在的甲硫氨酸亚砜还原酶（methionine sulfoxide reductases, Msrs）可催化甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸,使其所在蛋白质恢复活性。甲硫氨酸亚砜还原酶的这种催化还原作用,在蛋白修复及间接抗氧化方面发挥着重要的作用。目前,关于Msrs的研究主要集中在生物抗氧化及寿命调节方面,在蜜蜂中的研究很少。蜜蜂做为一种授粉昆虫,在农业生产及维持生态平衡中起重要作用。蜜蜂外出采蜜时会遭受到多种环境胁迫,为明确MsrA在蜜蜂抗氧化及发育中的作用。本研究以中华蜜蜂（Apis cerana cerana）为材料,首次从中华蜜蜂中克隆得到甲硫氨酸亚砜还原酶A（AccMsrA）基因,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及免疫组化的方法,首次分析了AccMsrA在昆虫不同发育阶段转录水平的变化,探索了其在紫外线（30 mj/cm2）、高温（43℃）及H2O2（2 mM）三种不同氧化刺激下的表达变化,为进一步研究该基因的功能及作用机理奠定了基础。主要研究结果如下:1、通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从中华蜜蜂中克隆得到MsrA基因,命名为AccMsrA,其GenBank注册号为HQ219724,cDNA全长1,540 bp,包含136 bp的5′UTR,753 bp的3′UTR和651 bp的ORF,编码一个有217个氨基酸残基,分子量约为25 kD的蛋白。同源分析得出AccMsrA同来源于埃及斑蚊、榕果蝇、致倦库蚊中的几种MsrA的同源性分别为49.6%、45.8%和51.3%。序列分析发现,AccMsrA具有MsrA的保守区,该保守区内存在典型特征序列GCFW,其中的半胱氨酸残基是其催化还原过程中的一个活性位点。cDNA序列与基因组序列比对后发现AccMsrA基因组序列内存在四个内含子,其中一个内含子位于5′UTR内。2、通过iPCR的方法获得了1,364 bp的AccMsrA基因启动子序列,经软件分析发现,该区域中存在tramtrack （Ttk）、cell factor 2-II （CF2-II）、hunchback （Hb）、Broad-Complex （BR-C）四种与发育相关的顺式作用元件,还有五个heat shock factor （HSF）热激响应元件。qRT-PCR检测到AccMsrA在五日龄幼虫及成虫头部具有较高表达。推测AccMsrA参与了蜜蜂的生长发育调节并在成虫不同组织部位存在表达差异。此外,AccMsrA的转录水平受紫外线（30 mj/cm2）、高温（43℃）和H2O2（2 mM）的诱导而提高,表明其在抵抗外界氧化刺激过程中发挥重要的作用。3、分别以pMD18-T simple和pET-30a（+）为克隆载体和表达载体构建了AccMsrA基因编码区的原核融合表达载体AccMrsA-pET-30a（+）,转化大肠杆菌BL21（DE3）并对其表达条件进行优化,在IPTG诱导下表达出大小约为29 kDa的融合蛋白。大量诱导表达目的蛋白,经纯化后免疫小鼠,采集含多克隆抗体的血清,通过Western blot鉴定其具有特异性并测定得出其效价为1:1000。4、通过对五日龄蜜蜂幼虫的免疫组化定位得出AccMsrA在五日领幼虫体内主要存在于腹部及肠壁,进一步推测AccMsrA可能参与蜜蜂从幼虫到蛹变态发育过程中腹部器官的发育调节。