本研究利用定点突变和随机突变的方法，对扩展青霉脂肪酶（Penicilliumexpansum lipase，PEL）进行了蛋白质工程改造。　　 1.PEL的定点突变　　 采用重叠延伸PCR的方法，对扩展青霉脂肪酶进行多个点突变，选取了十一个突变位点，构建了7个单点突变体和8个叠加突变体（与随机突变体ep8叠加）。将获得的突变基因在毕赤酵母中表达，并进行酶学性质的研究。　　 （1）P197E的单点突变及叠加突变：PEL-P197E酶活为556U/mL，Tm值比野生型提高了0.9℃。PEL-ep8-P197E酶活为592U/mL，其Tm值比野生型脂肪酶PEL的提高2.8℃，比随机突变体PEL-ep8提高2.2℃；此外，叠加突变体PEL-ep8-P197E的底物特异性发生了改变。　　 （2）K152R的单点突变及叠加突变：PEL-K152R酶活为530U/mL，PEL-ep8.K152R酶活为416U/mL，二者的热稳定性与与野生型无明显差别。　　 （3）P102L的单点突变及叠加突变：PEL-P102L酶活为300U/mL。PEL-ep8-P102L的酶活为612U/mL，最适作用温度提高了5℃，Tm比野生型提高了3.6℃，比随机突变体提高了2.6℃。　　 （4）N166D的单点突变及叠加突变：PEL-N166D、PEL-ep8.N166D的酶活分别为236 U/mL、252U/mL，PEL-ep8-N166D的Tm比野生型PEL下降1.1℃，比随机突变体下降2.1℃。　　 （5）P163A的叠加突变：PEL-ep8-P163A的酶活比野生型降低6.3％，比随机突变体降低33.8％；其Tm比野生型PEL提高了1.0℃，与随机突变体一致。　　 （6）K120R、M193V的叠加突变：PEL-ep8-K120R的最适作用降低了5℃；酶活降低较明显；热稳定性比野生型降低1.5℃，比随机突变体PEL-ep8降低2.5℃。PEL-ep8-M193V的酶活很低，仅有40 U/mL。　　 （7）G205A、K94D、K94R、W169N的单点突变：PEL-G205A、PEL-K94D、PEL-K94R、PEL-W169N在YPOM板上均没产生明显的透明圈。　　 2.PEL的随机突变　　 通过易错PCR的方法对扩展青霉脂肪酶进行随机突变，经过平板透明圈法的初筛和摇瓶复筛获得两株热稳定性有所提高的突变体HR2、HR3。　　 HR2的酶活为498UJ/mL，Tm值为39.3℃，比野生型脂肪酶PEL的提高了0.6℃。测序结果表明：HR2突变体脂肪酶基因第246位的A突变为G，即脂肪酶的第82位的Lys（AAG）突变为Arg（AGG），同时还产生了一个同义突变，第790位的T突变为C，即编码Ala的基因由GCT突变为GCC。　　 HR3的酶活为552U/mL，Tm值为42.1℃，比野生型脂肪酶PEL的提高了3.4℃。测序结果表明：HR3突变体脂肪酶基因第204位的T突变为C，即脂肪酶的第68位的Leu（CTC）突变为Pro（CCC）；第426位的A突变为G，即脂肪酶的第142位的Lys（AAG）突变为Arg（AGG）。　　 综上，本研究通过定点突变共构建了15个脂肪酶突变体，获得了两株较好的突变体：①PEL-ep8-P197E的热稳定性在随机突变体PEL-ep8的基础上，进一步提高了2.2℃，比野生型PEL提高了2.8℃，酶活为592U/mL。②PEL-ep8-P102L的热稳定性在随机突变体PEL-ep8的基础上，进一步提高了2.6℃，比野生型PEL提高了3.6℃，最适作用温度降低5℃，酶活为612U/mL。此外，本研究还通过随机突变获得一株较好的突变体，HR3热稳定性比野生型提高了3.4℃，酶活为552U/mL。