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染料木黄酮(genistein,GEN)是一种典型的植物雌激素,其具有拟雌激素效应,因此可对男性生殖功能产生影响。然而,具体的潜在机制仍然不明。miRNA是一类非编码RNA,可以通过结合靶基因3-UTR区,并沉默靶基因来发挥生物学功能。已有研究指出miRNA在精子生成中发挥重要作用。此外有报道指出,miR-17-92在精子生成中发挥重要作用,并且雌激素可以导致miR-17-92表达发生改变。为了探讨miR-17-92是否在GEN暴露引起的精子生成障碍中发挥作用,我们通过检测不育男性受试者尿液GEN暴露水平以及精浆中miR-17-92簇miRNA表达水平,发现miR-19b-1、miR-20a和miR-92a-1在GEN较高暴露组显著高表达,并且该组受试者精子活力显著下降,这就提示我们miR-17-92可能在GEN暴露引起的精子生成障碍中发挥作用。随后我们利用成年ICR小鼠,使用不同剂量GEN(包括0,0.5,5,50以及250 mg/kg/day)灌胃染毒35天,发现小鼠附睾精子的平均速率(VAP)、直线速率(VSL)和曲线速率(VCL)在5 mg/kg/day剂量组显著减少,进一步研究发现,该剂量组小鼠睾丸组织中miR-17和miR-20a的表达水平显著高于对照组。通过对比人和小鼠中的结果,我们发现miR-20a在人和小鼠中均呈现显著高表达。通过生物信息学方法分析,发现Limk1是miR-20a的靶基因,并且该基因在精子生成中发挥重要作用,基因和蛋白表达水平检测结果也表明,Limk1表达水平在GEN染毒组显著下降,双荧光素酶报告基因实验也表明Limk1是miR-20a的靶基因。因此这些结果表明,Limk1作为miR-20a的靶基因,可能在miR-20a参与的GEN暴露致精子生成障碍中发挥作用。本文分为几个部分展开讨论: 第一部分:miR-17-92基因簇miRNA表达水平与GEN暴露的关联研究 目的: 在人群水平研究miR-17-92基因簇miRNA和GEN暴露致精子生成障碍的关联。 方法: 1.使用UPLC-MS/MS的方法,检测了130名不育男性尿液GEN暴露水平; 2.通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术,检测受试者精浆中的miR-17-92表达水平; 3.根据受试者GEN内暴露水平,将受试者分成四组,分析精浆miR-17-92表达水平与GEN暴露之间的关联。 结果: 1.通过比较不同GEN暴露组受试者的精液参数,我们发现在所纳入的不育受试者中,GEN较高暴露组(即组3,GEN暴露量为76.32-281.96 ng/ml)的受试者精子活力与GEN低暴露组相比显著下降(P<0.01); 2.受试者精浆中miR-19b-1、miR-20a和miR-92a-1在组3中显著高表达(P<0.05),其余几条miRNA则未观察到显著性差异。 结论: 在男性不育患者中,较高暴露的GEN与精子生成障碍有关,并且主要集中在精子活力,而miR-17-92可能在GEN暴露导致的精子生成障碍中发挥作用。 第二部分:miR-17-92基因簇miRNA在GEN染毒小鼠生精障碍中的作用及机制 目的: 在GEN染毒小鼠模型中研究miR-17-92基因簇中关键miRNA在GEN染毒引起的小鼠精子生成障碍中的作用以及机制。 方法: 1.通过使用不同剂量的GEN(0,0.5,5,50和250 mg/kg/day)对7周龄雄性ICR小鼠灌胃染毒35天,以研究不同剂量GEN对小鼠精子生成的影响; 2.通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术,检测小鼠睾丸组织中miR-17-92表达水平; 3.结合人群结果,筛选出人鼠中共同差异的miR-17-92基因簇miRNA,随后通过靶基因预测软件,筛选出共同靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-17-92基因簇关键miRNA与靶基因结合特异性; 4.使用qRT-PCR和Western blotting技术,检测靶基因表达水平。 结果: 1.雄性ICR小鼠经5 mg/kg/day的GEN灌胃处理后,小鼠附睾精子运动参数,包括平均速率(VAP)、直线速率(VSL)和曲线速率(VCL)三个指标,均呈显著降低; 2.小鼠睾丸组织miR-17及miR-20a在5 mg/kg/day组显著高表达,结合人群结果,发现miR-20a在人鼠中均呈现显著差异表达,因此选定miR-20a作为关键靶标miRNA; 3.通过靶基因预测软件以及人鼠通路富集结果比对,发现肌钙蛋白细胞骨架调节通路是人鼠中均存在的miR-20a靶基因富集通路,并且该通路与基于细胞骨架调节的精子发生密切相关,其中Limk1在该通路中发挥重要调控作用; 4.双荧光素酶报告基因实验结果表明,Limk1是miR-20a的靶基因; 5.Limk1在5 mg/kg/day的GEN灌胃组小鼠睾丸组织中显著低表达,并且蛋白表达结果与基因表达结果一致。 结论: 1.GEN在5 mg/kg/day灌胃剂量下可以导致雄性成年ICR小鼠精子生成障碍; 2.Limk1作为miR-20a的靶基因,可能在GEN暴露导致的精子生成障碍中发挥作用。