表观遗传学是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下,基因功能发生了可遗传的变化,是以DNA甲基化谱、染色质结构状态和基因表达谱描述遗传现象的一门科学,即研究从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴的遗传学分支。主要包括DNA甲基化、基因组印记、组蛋白修饰和X染色质失活。DNA甲基化是哺乳动物遗传和遗传外修饰的重要调控方式之一,固有DNA甲基化水平和模式的变化会导致生物的表型异常甚至死亡,5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)的水平和模式是由DNA甲基化和去甲基化共同决定的,胞嘧啶的甲基化修饰是一个动态可逆过程。5-mC存在去甲基过程,DNA中的5-mC可被进一步修饰形式为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5-hmC),5-hmC是在1950s被发现和报道的,但对这种碱基的分布和重要性一直缺乏详细理解。5-mC可被TET(ten-eleven translocation)蛋白家族进一步转化为5-hmC,该过程是DNA去甲基化的1个必要阶段。5-hmC的发现和TET蛋白的研究为DNA甲基化/去甲基化及其生物学功能提供了新的视点。在原生殖细胞和胚胎发育的整个过程中,会发生全基因组范围内的DNA甲基化模式重排,而这种改变引起的染色体状态等一系列变化会决定细胞的分化方向。在受精卵中观察到5-hmC的升高伴随着5-mC的降低,提示5-mC可能被转化为5-hmC。TET蛋白及5-hmC参与了受精过程中父本基因组的重编程过程,小鼠受精卵的父本基因组中存在着5-mC的全面消除的现象,与此同时,5-hmC含量却显著增加的现象；相对应的母本基因组中却含有大量5-mC,而5-hmC含量极少。重要的是父本和母本的5-mC/5-hmC这种独特分布在有丝分裂单细胞期双细胞期以及后来卵裂阶段胚胎期都持续存在。这种特征与小鼠TET3的蛋白表达变化相一致,因此TET3介导的5-mC羟基化修饰可能在哺乳动物早期生命周期中发挥着重要作用。TET酶和5-hmC在胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)和小鼠早期胚胎发育的研究,表明它们在胚胎干细胞自我更新和维持,以及内细胞团(Innercell mass,ICM)细胞的特异性分化中发挥重要作用。通常TET1和TET2在小鼠胚胎干细胞内表达比TET3丰富,这是由于TET1和TET2表达受到了多能性调控网络及胚胎干细胞分化潜能的调控。最近的一篇报道,在猪的早孕胚胎中,TET3在2细胞期高表达,而TET1,TET2则富集在囊泡阶段。然而,关于TET是否也存在人类早孕绒毛组织中,会发挥什么样的作用?三种TET酶与早期自然流产有什么相关性?这是一个富于挑战性的研究领域。已有研究证明在人类胎盘中特异位点的DNA甲基化能够影响胎盘中DNA结合蛋白的结合能力,这对于理解DNA甲基化模式在DNA结合元件募集及随后的转录中的作用有重要意义。同时,甲基化可能作用于早孕绒毛组织,即甲基化的异常可能引发胚胎停止发育、导致自然流产,因有学者研究得出：与正常早孕相比,在早孕流产患者的绒毛中DNMT1表达量显著减少同时DNA甲基化水平明显下降,提示甲基化的异常可能引发胚胎停止发育、导致自然流产。我们的前期研究表明,PEG1、H19、LIT1基因甲基化程度的改变可能与自然流产的发生相关,即甲基化异常导致的多个基因表达异常可能是人类着床前胚胎质量不佳、着床前后胚胎停止发育的重要原因之一,但去甲基化在早期胚胎发育的过程中所发挥的作用仍然未知,许多问题亟待解决。流产发生是一个复杂的过程,在近40周的妊娠期内,内、外因素交互作用共同影响着母体与胎儿,至今仍有部分原因不明。早期自然流产(early pregnancy loss, EPL)约占全部临床妊娠(>6周后超声识别)的10-15%。哺乳动物的正常发育取决于表观遗传学调控机制准确无误地运行。 其中尤为重要的是发生在原生殖细胞和胚胎中的基因组范围内的DNA甲基化模式重排等表观遗传学修饰。这些过程的异常可能影响了基因的表达,参与了着床后胚胎停止发育(即自然流产)的发病机制。DNA的甲基化与去甲基化对维持胚胎的正常发育和正常妊娠至关重要,5-mC、5-hmC的动态变化、TET蛋白的表达参与决定着床前后早期胚胎的命运。本项目拟探索TET酶及5-mC,5-hmC在人类早孕期绒毛组织中的表达量及表达趋势,进而,我们将对不明原因流产的绒毛组织进行研究,与正常绒毛组织对比分析,总结去甲基化,或是相关酶及产物在胚胎发育过程中可能起到的作用,及与人类自然流产的相关性。第一部分TET酶及5-mC,5-hmC在人类早孕期绒毛组织中的表达趋势[研究目的]多项研究已阐明TET蛋白及催化生成的5-hmC参与了胚胎干细胞的维持和分化过程,去甲基化可能存在于原生殖细胞和胚胎早期发育的各个阶段。最近的一篇报道,在猪的早孕胚胎中,TET3在2细胞期高表达,而TETl,TET2则富集在囊泡阶段。TET1,TET2,TET3三种蛋白都有不同组织及细胞内将5-mC转变成5-hmC的功能。TET蛋白和5-hmC的研究为DNA甲基化/去甲基化及其生物学功能提供了新的视点,关于它们的表达及功能在人类绒毛组织中的研究有限。活跃的DNA甲基化及去甲基化在即将发育成胚胎与即将发育成胚外谱系的细胞间发挥着重要的作用,无论是胚胎种植前还是种植后。绒毛组织的生物学功能类似于胚胎干细胞,那么TET酶及5-mC,5-hmC在人类早孕期绒毛组织中的表达量及表达趋势是怎样的呢?我们对此做一研究。[研究方法]1.本研究经医院伦理委员会批准,标本收集经患者知情同意。2012年9月至2013年5月于广州医科大学第二附属医院妇产科门诊收集：自愿选择终止妊娠妇女的正常绒毛31例。绒毛样本均为孕6-8+6周,母龄18-42岁。根据绒毛组织的不同发育时期分为3个研究组：①6周(n=10),②7周(11=10),③8周(n=11)。2.人流手术后,即用生理盐水漂洗2-3次以去除绒毛组织上带有的血迹,采用50m1无菌离心管收集绒毛组织,内置1xPBS溶液,显微镜下挑选、剪取绒毛组织,分装入1.5m1 EP管内,冻存-80°。首先进行TET mRNA的检测：应用BiooPure RNA Isolation Reagent (Bioo, USA)提取绒毛组织RNA,RNA的纯度和浓度鉴定后行逆转录反应(Fermentas K1622严格按照试剂操作说明)。RNA水平实验得出初步结论后,Western-bloting方法用于TET蛋白表达的验证： 绒毛组织组织总蛋白的提取,蛋白质变性、转膜、封闭及抗体孵育、显影及图像分析,完成实验。最后一步,全基因组5-hmC及5-mC的定量检测。采用Wizard(?) Genomic DNA Purification Kit(Promega)试剂盒提取DNA,DNA的纯度和浓度鉴定后,严格按照(Epigentek公司)MethylFlash Hydroxymethylated DNA Quantification Kit-及.MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit操作说明书操作,检测样品的上样检测量是200ng。3.采用SPSS 16.0统计软件(Statistical Package for the Social Sciences),数据用均数±标准误(x±E)表示。组间数量资料比较采用t-test或One-way ANOVA,方差不齐时采用Welch近似方差检验,双变量相关分析。设双侧检验,P<0.05为差异显著水平,P<0.01为差异极显著水平。[研究结果]1.采用荧光定量PCR技术检测TET1, TET2, TET1 mRNA在人类早孕绒毛组织中的表达情况,TET1, TET2, TET1的表达均会随着孕周的增加而下降,尤以TET3下降明显(6周vs.7周,P<0.05；6周vs.8周,P<0.05)。三种TET mRNA均在孕6周的绒毛组织中表达是最高的,与孕8周组相比有明显的统计学意义。2.我们应用Western-bloting的方法验证了TET1, TET2, TET3蛋白在人类早孕绒毛组织中的表达,进一步证实了TET mRNA水平上的实验结果。实验过程中所应用标本与RT-PCR中一致,TET1,TET2,TET3蛋白的表达同样会随着孕周的增加而下降,而且在各组之间的表达存在着明显的统计学差异。在孕6周组,TET1,TET2,TET3蛋白的表达明显高于孕7周组和孕8周组。在7周和8周的组间比较上未得到统计学意义的结果。3.5-hmC在早孕绒毛组织中的表达与TET酶的表达趋势比较一致,随着孕周数的增加,表达量下降。以孕6周的绒毛组织中表达最高(6周vs 7周,P<0.01；6周vs 8周,P<0.01)。同时,5-mC在早孕绒毛组织中的表达也会随着TET酶的表达量的减少而呈下降趋势(6周vs 8周,P<0.01；7周vs 8周,P<0.01),在孕6周时表达量显著高于其它孕周数(P<0.05)。4.相关分析的结果显示：在人类早孕绒毛组织中,TET3 mRNA的表达和5-hmC定量有相关性(r=0.450,P<0.05)。但TET2和TET3的表达与5-hmC定量的相关性均不显著(P>0.05)。[研究结论]1.本研究发现TET1,TET2,和TET3 mRNA在人类早孕期绒毛组织中的表达是随着孕周的增加而逐步下降的(6周,7周,8周)。显而易见,在这三个实验组的比较中,TET1,TET1,和TET3mRNA在孕6周时表达最旺盛。同样的标本,TET蛋白的半定量检测同时证明了这一下降趋势的存在。2. TET1、TET2、TET3在早期妊娠发育过程中确有在母胎界面的绒毛组织中表达,并且在孕6-8周的阶段,有逐渐减弱的趋势。3个TET蛋白在早孕绒毛组织内可能发挥着将5-mC转变成5-hmC的作用。3.5-hmC及5-mC在早孕绒毛组织中的表达与TET酶的表达趋势比较一致,随着孕周数的增加,表达量下降,并以孕6周的绒毛组织中表达最高,孕8周时表达最低。由此猜测,在早期妊娠自孕6周进展到孕8周的阶段的绒毛组织中,无论是甲基化的过程,亦或是去甲基化的过程都在减弱。4.在人类早孕绒毛组织中,TET3的表达和5-hmC定量有显著相关性。但TETl和TET2的表达与5-hmC定量相关性不大。我们猜测在人类早期绒毛组织的去甲基化过程中,TET3可能发挥了更为重要的作用。5.我们仅仅分析了TET、5-mC、5-hmC在早期妊娠绒毛组织(孕6-8周)的表达量及表达趋势,并且很难扩充研究组,如对早孕期各种孕周数的研究。第二部分TET酶的缺乏及相关的去甲基化异常与人类早期自然流产的相关性研究[研究目的]表观遗传在着床前后的早期胚胎发育中发挥着重要的调控作用。我们的前期研究发现：PEG1、H19、IGF2、GRB10等印记基因甲基化程度的改变可能与自然流产的发生相关,甲基化转移酶3A(DNAmethyltransferases DNMT3A)基因启动子区单核苷酸多态性(SNP)在早/中期妊娠丢失中可能发挥了一定作用。另有文献报道,与正常早孕相比,在早孕流产患者的绒毛中DNMT1表达量显著减少同时DNA甲基化水平明显下降,提示甲基化的异常可能引发胚胎停止发育、导致自然流产。DNA甲基化在胚胎早期发育中具有重要意义。但是关于胚胎发育过程中,DNA去甲基化的启动机制和作用机理还需进一步地研究,以及TET酶相关的去甲基化通路缺陷是否引起人类早期妊娠丢失不甚明了。本部分拟从不同时期、不同类型停止发育的早孕绒毛组织的甲基化/去甲基化动态变化的角度,研究TET蛋白,5-mC,5-hmC在人类早孕绒毛组织中全基因组的变化模式,分析去甲基化与自然流产的病因和发病机制之间的关系。[研究方法](1)本研究经医院伦理委员会批准,标本收集经患者知情同意。2012年9月至2013年5月于广州医科大学第二附属医院妇产科门诊收集：自愿选择终止妊娠妇女的正常绒毛31例。2012年5月至2013年5月于广州市妇女儿童医院妇产科门诊收集：早期胚胎停止发育的绒毛30例。绒毛样本均为孕6-8+6周,母龄18-42岁。收集人早孕期绒毛组织分为两组：一组为胚胎停育,作为研究组(EPL组)；二组为正常妊娠,作为对照组。胚胎停育的标本又根据胚胎发育情况分为3个亚组：空囊型(GS,n=9),②有胚芽无胎心型(EM,n=18)③有胎心后停育型(FH, n=3)。为与正常妊娠组相匹配,再根据不同发育时期分为3个亚组：①6周(n=7),②7周(n=15),③8周(你=8)。(2) 获取绒毛组织后,即用生理盐水漂洗2-3次以去除绒毛组织上带有的血迹,采用50m1无菌离心管收集绒毛组织,内置1 xPBS溶液,显微镜下挑选、剪取绒毛组织,分装入1.5ml EP管内,冻存-80°。第一步,流产组织的绒毛取部分行G显带染色体分析。第二步,TET mRNA的检测：应用BiooPure RNA Isolation Reagent (Bioo, USA)提取绒毛组织RNA, RNA的纯度和浓度鉴定后行逆转录反应(Fermentas K1622)严格按照试剂操作说明)。第三步,Western-bloting方法用于TET蛋白表达的验证：绒毛组织组织总蛋白的提取,蛋白质变性、转膜、封闭及抗体孵育、显影及图像分析,完成实验。第四步,免疫组化的方法再次验证TET。第五步,全基因组5-hmC及5-mC的定量检测。采用Wizard(?) Genomic DNA Purification Kit (Promega)试剂盒提取DNA, DNA的纯度和浓度鉴定后,严格按照(Epigentek公司)MethylFlash Hydroxymethylated DNA Quantification Kit.及MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit操作说明书操作,检测样品的上样检测量是200ng。(3) 采用t-test或One-way ANOVA进行组间数量资料比较,方差不齐时采用Welch近似方差检验。设双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异极显著水平。应用SPSS 16.0统计软件,数据用均数±标准误(x±E)表示。[研究结果]1.正常妊娠组的TET1,TET2,TET3 mRNA水平均高于EPL组(TET1 P<0.01, TET2 P<0.01, TET3 P<0.05)。也就是说,在孕6-8周的早期妊娠中,与正常妊娠相比,流产的绒毛组织中三种TETmRNA的含量有所下降。在EPL组中,以孕周数作为分组依据的三个亚组中,三种TETmRNA的表达在孕6周,7周,8周组之间比较无显著差别(P>0.05)。另外根据临床类型分组中,无论是在空囊型的早孕绒毛,有胚芽无胎心型流产的早孕绒毛,还是已有胎心后停育型的流产绒毛组织中,：TET1,TET2,TET3 mRNA表达均未见差别。2. TET1,TET2和TET3蛋白的表达随着孕周的增加而下降,以EPL组的明显减弱。在孕6周组中,TET1,TET2,TET3蛋白的表达明显高于孕7周组和孕8周组以及EPL组。免疫组化图片显示：TET1,TET2和TET3主要表达于绒毛滋养细胞,呈以细胞浆为主的表达,细胞核为阴性反应。仍然是表达在孕6周时最为明显。3. 5-mC在正常妊娠的绒毛组织中表达低于在流产的绒毛组织中的表达,差异达到显著水平。但是,5-hmC在绒毛组织中的表达量整体偏低,流产组与对照组的比较无差别。4.根据染色体正常与否又将病理组分成2个亚组：染色体正常组(N组,n=16)和染色体异常组(A组,n=11)。将自然流产组绒毛的TET1,TET2,TETS mRNA及5-hmC and 5-mC检测数据在染色体正常组与染色体异常组之间进行非配对检验分析,结果均不显著(P>0.05)。[研究结论]1.与正常妊娠相比,TET1,TET2, TET3 mRNA在流产组中表达量明显降低,western-bloting和免疫组化的蛋白检测方法同时证明了这种趋势的存在。2.我们成功的完成了绒毛组织中TET酶的Western-bloting和免疫组化实验,进一步验证了TET酶在人类早孕绒毛组织中是确实存在的,也就是说在早孕期间的母胎界面,存在着去甲基化的过程。在免疫组化的图片上可以看到TET表达在滋养细胞的细胞浆内,无论是细胞滋养细胞还是合体滋养细胞,均可见TET的富集。3.TET酶的缺乏与人类早期自然流产的发生有一定相关性,TET在绒毛组织内可能发挥着将5-mC转变成5-hmC或是其他产物的作用。4.流产组与正常组对比,绒毛组织中TET酶表达量的降低,5-mC的表达量升高差异显著,而5-hmC在绒毛组织中的表达量整体偏低,无变化。流产的绒毛细胞发生了异常甲基化,同时去甲基化过程缺失。异常发育的胚胎的病理生理变化中,去甲基化状态的改变或许只是其中的一个步骤,是流产发生后绒毛组织的一个病理变化过程。5.染色体异常导致的病例中,去甲基化的状态没有改变,与正常妊娠相比都处于较低水平。说明去甲基化的改变与染色体异常无直接关系。两种不同的机制各自在流产发生中发挥着自身的作用。6.不足之处在于,样本量较小,且仅在DNA水平对5-mC,5-hmC的含量进行分析,尚不能得出确切结论;若能检测绒毛组织的整体去甲基化水平,及去甲基化芯片筛查相关基因,则结论可靠性更高、更具有说服力。