【摘 要】
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蜕皮激素在虾蟹类动物的性别分化、生长发育和繁殖中具有关键的调控作用,然而其分子调控机制尚不明确。开展蜕皮激素信号途径的研究,对于阐明甲壳类动物的蜕皮机制,促进虾蟹养殖
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蜕皮激素在虾蟹类动物的性别分化、生长发育和繁殖中具有关键的调控作用,然而其分子调控机制尚不明确。开展蜕皮激素信号途径的研究,对于阐明甲壳类动物的蜕皮机制,促进虾蟹养殖业的发展具有重要意义。SNIP1(Smad nuclear interacting protein)是一个与Smad相互作用并含有多个锌指结构的蛋白,具有特异性的DNA结合活性,参与了多个信号通路的调控。克氏原螯虾,也称小龙虾,因肉味鲜美广受人们欢迎,近年来已经成为重要的水产养殖品种。本研究旨在探讨 SNIP1在克氏原螯虾蜕皮激素信号通路中的功能,取得的主要结果如下: 1、本实验根据已有部分序列,设计特异性引物克隆了克氏原螯虾 Smad核互作蛋白1(SNIP1)基因的开放式阅读框序列(ORF,open reading frame),生物信息学分析表明SNIP1基因的开放式阅读框序列全长为867bp,编码的蛋白质含有288个氨基酸残基,预测的成熟蛋白理论分子量分子量为34.9KDa,其等电点为6.18。其蛋白质C末端具有高度保守的FHA结构域,而其N端具有一段核定位序列,进化树分析表明克氏原螯虾SNIP1基因与无脊椎动物SNIP1基因亲缘关系最近。 2、通过双酶切法构建了重组质粒pET28a-Pc-SNIP1,转化大肠杆菌BL21后采用IPTG诱导表达。转化至 E. coli Rosetta(DE3),用不同浓度 IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳和 Western blot的检测结果表明克氏原螯虾SNIP1融合蛋白能够在原核表达系统中高效表达,重组蛋白分子量大小为35KDa左右。通过Ni柱亲和层析柱纯化重组蛋白,使用纯化的蛋白制备多克隆抗体,获得的抗体的效价为1:9000。 3、提取克氏原螯虾肝胰腺、肠、肌肉、鳃、心脏、胃6个不同组织的总蛋白和总RNA,通过免疫印迹法和荧光定量PCR法分析克氏原螯虾在不同组织中的表达分布情况。结果表克氏原螯虾SNIP1基因在心脏中的表达量最高。 4、注射蜕皮激素后克氏原螯虾肝胰腺中SNIP1基因的表达量显著增高。荧光定量PCR及Western bloting结果表明,通过siRNA干扰抑制SNIP1基因表达能够显著影响蜕皮响应基因在克氏原螯虾肝胰腺组织中的表达水平。 综上所述,SNIP1基因是一个蜕皮响应基因,参与克氏原螯虾蜕皮激素调节的生理过程。
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