急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是一类非常严重的缺血性心脏疾病,主要指由冠状动脉急性、持续性缺血缺氧引起的心肌坏死,已成为心血管疾病中死亡率不断增加的主要原因。心室重构和心力衰竭是影响心血管事件发生、患者长期生存率和生存质量的两个重要因素。研究表明,在心肌梗死区和非梗死区均可观察到大量的心肌细胞凋亡现象,其中部分细胞的不可逆凋亡会直接加重心肌损伤。MI发生后,梗死边缘区的缺血性应激可以进一步诱导心肌细胞凋亡,加重活性心肌部分的心室重构,进而导致心力衰竭。因此,心肌细胞凋亡干预被认为是预防急性MI后的心室重构和心力衰竭发展以及改善MI患者预后的重要策略之一。深入研究MI引发的心肌细胞凋亡和抗凋亡机制,可以为干预治疗提供有效的作用新靶点,具有重要的临床指导意义。MicroRNA (miRNA)是一类由18～25个核糖核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA,主要通过与靶基因的3’非编码区(3’UTR)结合,促进靶基因mRNA降解,或抑制靶基因的翻译,在转录后水平负调控靶基因的表达,进而参与多种心血管疾病的病理生理过程。MiR-7a是一种常见的肿瘤抑制因子,在哺乳动物体内表现出高度保守性。有研究指出,miR-7a在心肌缺血/再灌注损伤、心力衰竭等MI相关过程中表达异常。相关机制研究则表明,miR-7a可以通过调控靶基因PARP的表达,减少缺血/再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡。另一方面,过表达miR-7a可以避免未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)诱导的心肌细胞凋亡。以上结果提示miR-7a可能参与不同病理状态下的心肌凋亡过程,但是目前关于miR-7a的功能调控机制和下游调节通路还不完全清楚。环状RNA (Circular RNA, circRNA)是一种新型的在真核细胞中广泛表达的内源性非编码RNA,可经由特殊的选择性剪切产生,具有形成共价闭合环的潜能。与线性mRNA类似,circRNA具有稳定表达,以及组织、发育阶段特异性表达等特征,暗示这些circRNA可能发挥某种特殊的生物学功能。小脑变性相关蛋白1的反义转录物(antisense to the cerebellar degeneration-related protein1 transcript, Cdrlas),又称为miR-7的环状RNA海绵(circular RNA sponge for miR-7, ciRS-7),是目前研究较为深入的一种与人类疾病相关的circRNA。生物信息学分析结果表明, Cdr1as(或ciRS-7)含有至少60个miR-7保守结合位点,可以作为miR-7"海绵”,发挥海绵样吸附作用,进而抑制miR-7功能。有研究表明,在小鼠大脑的发育中脑区域,可观察到Cdr1as和miR-7的共同高表达,且Cdr1as可以通过结合miR-7发挥关键调控作用。在MI过程中,Cdr1as是否通过结合miR-7a参与心肌细胞凋亡相关信号通路的调控,目前尚未有相关研究报道。姜黄素是从中药姜黄中提取的一种多酚类单体药物,在对抗炎症、氧化、感染、肿瘤、动脉粥样硬化,以及保护冠状动脉等方面的具有广泛应用。近年来研究表明,姜黄素还具有心肌细胞保护功能,但其具体分子机制尚不清楚。本文拟通过体内和体外实验验证姜黄素是否通过调节miR-7a和细胞凋亡相关信号特异性蛋白1(SP1)的表达在MI过程中发挥抗心肌凋亡的作用。本研究分四部分进行：第一部分：心肌梗死损伤对小鼠心肌细胞中Cdr1as和miR-7a表达水平的影响第二部分：MiR-7a通过调控PARP和SP1的表达影响缺氧导致的心肌细胞凋亡第三部分：Cdr1as通过抑制miR-7a的靶向调控功能促进小鼠心肌梗死第四部分：姜黄素通过调控,iR-7a表达保护小鼠心肌细胞避免心肌梗死损伤第一部分：心肌梗死损伤对小鼠心肌细胞中Cdrlas和miR-7a表达水平的影响研究目的1.明确小鼠梗死心肌组织中Cdr1as的表达水平是否发生变化；2.确定小鼠梗死心肌组织中Cdr1as与miR-7a的表达变化是否一致；3.探究缺氧培养条件下,小鼠心肌细胞中Cdr1as和],iR-7a的表达变化是否一致。研究方法1.MI小鼠模型建立用0.8%戊巴比妥钠麻醉小鼠,仰卧固定后,口腔放置气管插管,沿胸骨左缘第四肋间隙剪开皮肤,行开胸手术。小心剪开心包后,永久性结扎冠状动脉左前降支(LAD),构建MI小鼠模型。其中,假手术(sham)组小鼠同样于LAD下穿线,但不结扎血管。2.MI模型评价术后24 h,检测小鼠心室的心肌梗死面积、缺血危险区比例,以及血清LDH含量。3.细胞培养将分离提取的小鼠原代心肌细胞和MCM心肌细胞分别接种至含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于37℃、含5% CO2的恒温培养箱中培养。4.缺氧处理与分组常规培养心肌细胞至对数生长期后,接种至新鲜DMEM完全培养基中,分别置于含氧量为20%(对照)和0%的37℃恒温培养箱中培养。5. Real-time PCR检测Cdr1as的表达用Trizol试剂提取心肌组织和细胞中的总RNA后,逆转录合成cDNA。使用Cdr1as和β-actin特异性引物,进行实时定量PCR反应。以β-actin为内参基因,计算Cdr1as的表达水平。6. Real-time PCR检测miR-7a的表达用TRIzol试剂提取心肌组织和细胞中的总RNA后,进行miR-7a特异性反转录。使用miR-7a和U6特异性探针,实时定量PCR检测miR-7a的表达水平。其中,U6作为内参照。研究结果1.MI模型评价与未出现心肌梗死的sham组小鼠相比,MI组小鼠左心室中的心肌梗死面积和缺血危险区比例分别为60.0%和57.3%,提示小鼠MI建模成功。而且,相较于sham组小鼠,MI组小鼠血清的LDH含量增加了约2.4倍。2.MI促进Cdr1as和miR-7a的表达上调与sham组相比,MI术后6、12、24 h的小鼠心肌组织中的Cdr1as和miR-7a表达水平均显著上调,并表现出一定的时间依赖性。选用MI术后24 h作为后续实验观察点。3.缺氧诱导心肌细胞中Cdr1as和miR-7a的表达增加与正常培养的心肌细胞相比,缺氧培养3、6、12 h后,小鼠心肌细胞中的Cdr1as和miR-7a表达水平均显著增加,并同样表现出时间依赖性。选用缺氧培养12h作为后续实验条件。研究结论1.小鼠梗死心肌组织中Cdr1as的表达水平上调,且与miR-7a表达变化一致；2.缺氧处理可以诱导小鼠心肌细胞中Cdr1as和miR-7a的共同高表达。第二部分：MiR-7a通过调控PARP和SP1的表达影响缺氧导致的心肌细胞凋亡研究目的1.明确miR-7a是否靶向调控SP1的表达；2.探究PARP和SP1在miR-7a过表达减少缺氧导致的心肌细胞凋亡中的作用机制。研究方法1.细胞培养将MCM心肌细胞接种至含10%胎牛血清的DMEM培养基中,分别置于含氧量为20%和0%的37℃恒温培养箱中培养。2.细胞转染与分组使用Lipofectamine 2000转染miR-7a mimic或对照scrambled miRNA序列至MCM细胞,进行miR-7a过表达；转染pcDNA-PARP-SP1或对照pcDNA空质粒,进行PARP和SP1共表达。转染24 h后,实时定量PCR检测niR-7a、PARP和SP1 mRNA的表达水平,确定转染效果。3. Real-time PCR检测PARP和SP1 mRNA的表达水平提取转染后细胞总RNA,逆转录合成cDNA后,实时定量PCR检测PARP和SP1 mRNA的表达。以β-actin为内参基因,计算PARP和SP1 mRNA的表达水平。4. Western blot检测PARP和SP1的蛋白表达水平转染48 h后,用RIPA蛋白裂解液提取细胞蛋白,分别使用特异性抗体,检测PARP和SP1的蛋白表达水平。5.双荧光素酶报告基因检测构建包含SP13’UTR野生型或突变型、PARP 3’UTR野生型或突变型的双荧光素酶报告载体,与miR-7a mimic或对照scrambled miRNA序列共转染至MCM细胞后,使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒,检测各组MCM细胞中的萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)活性,并计算荧光素酶相对活性。6. Caspase-3活性检测缺氧处理各组MCM心肌细胞12h后,使用Caspase-3分光光度法检测试剂盒,检测各组MCM细胞的caspase-3活性。7.细胞凋亡检测缺氧处理各组MCM心肌细胞12h后,使用FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒,检测各组MCM细胞的细胞凋亡比例。研究结果1. miR-7a对PARP和SP13’UTR的靶向抑制miR-7a过表达可以显著降低PARP和SP1野生型报告基因组中的荧光素酶相对活性,相应突变型报告基因载体组中的荧光素酶相对活性则无明显变化。2. miR-7a靶向调控PARP和SP1的表达miR-7a过表达可以显著降低PARP、SP1的mRNA和蛋白表达水平。以上结果表明,PARP和SP1均为miR-7a的靶基因。3. miR-7a通过抑制]ARP和SP1表达,减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡miR-7a过表达可以显著降低缺氧诱导的caspase-3活性升高和细胞凋亡率增加。而进一步过表达PARP和SP1可以逆转miR-7a对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用。研究结论1. miR-7a可以靶向调控小鼠心肌细胞中PARP和SP1的表达；2. miR-7a通过抑制PARP和SP1的表达,减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡。第三部分：Cdrlas通过抑制miR-7a的靶向调控功能促进小鼠心肌梗死研究目的1.明确Cdrlas过表达对心肌细胞凋亡的影响；2.探究Cdrlas是否通过影响miR-7a靶基因PARP和SP1的表达,参与心肌细胞凋亡调控；3.验证miR-7a在Cdr1as促进小鼠心肌梗死中的作用机制。研究方法1.细胞培养将MCM心肌细胞接种至含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于37℃、含5% CO2的恒温培养箱中培养。2.细胞转染与分组使用Lipofectamine 2000转染pcDNA-Cdr1as或对照pcDNA空质粒至MCM细胞,进行Cdr1as过表达；共转染miR-7a mimic或对照scrambled miRNA序列,进行miR-7a共表达。转染24 h后,实时定量PCR检测Cdr1as和miR-7a的表达水平,确定转染效果。3. Real-time PCR检测PARP和SP1 mRNA的表达水平提取转染后细胞总RNA,逆转录合成cDNA后,实时定量PCR检测PARP和SP1 mRNA的表达。以β-actin为内参基因,计算PARP和SP1 mRNA的表达水平。4. Western blot检测PARP和SP1的蛋白表达水平提取细胞蛋白后,分别使用特异性抗体,检测PARP和SP1的蛋白表达水平。5. Caspase-3活性检测使用Caspase-3分光光度法检测试剂盒,检测各组MCM细胞的caspase-3活性。6.细胞凋亡检测使用FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒,检测各组MCM细胞的细胞凋亡比例。7.体内转染与MI小鼠模型建立通过心肌内注射pcDNA质粒溶液或miRNA慢病毒溶液,进行体内转染。3天后,永久性结扎LAD。术后24 h,检测小鼠心室的心肌梗死面积、缺血危险区比例,以及血清LDH含量。8.免疫组化检测PARP和SP1的蛋白表达取各组小鼠心肌组织,石蜡包埋切片后,免疫组化检测心肌组织切片中PARP和SP1的蛋白表达。研究结果1.Cdr1as过表达对miR-7a及其靶基因表达水平的影响转染pcDNA-Cdr1as后,Cdr1as的表达水平上调了约2.3倍,表明Cdr1as过表达细胞株构建成功。而且,Cdr1as过表达细胞株中,miR-7a的表达水平无明显变化,miR-7a靶基因PARP和SP1的表达水平则均显著增加。2. miR-7a过表达对Cdr1as诱导的心肌细胞凋亡的影响Cdr1as过表达可以显著增加MCM心肌细胞的caspase-3活性和细胞凋亡率,诱导心肌细胞凋亡。进一步过表达miR-7a,可以显著降低Cdr1as诱导的心肌细胞凋亡,提示Cdr1as可能通过抑制miR-7a活性,促进心肌细胞凋亡。3. Cdr1as通过抑制miR-7a的靶向调控功能,促进小鼠心肌梗死体内转染pcDNA-Cdr1as后,MI小鼠的心肌梗死面积、缺血危险区比例和血清LDH含量均显著增加,并伴随PARP和SP1的表达上调。体内共转染miR-7a,进一步过表达miR-7a则可以显著抑制MI小鼠的心肌损伤,同时下调PARP和SP1的表达水平。研究结论1.miR-7a过表达抑制Cdr1as诱导的心肌细胞凋亡；2. Cdr1as可以通过抑制]miR-7a功能,上调靶基因PARP和SP1的表达,进而促进小鼠心肌梗死。第四部分：姜黄素通过调控miR-7a表达保护小鼠心肌细胞避免心肌梗死损伤研究目的1.确定姜黄素对MI小鼠的心肌保护作用；2.研究姜黄素对MI小鼠心肌细胞中miR-7a和SP1表达水平的影响；3.探究miR-7a在姜黄素保护心肌细胞避免MI损伤中的作用机制。研究方法1.姜黄素给药与MI小鼠模型建立用姜黄素(50 mg/kg体重/天)或等量生理盐水连续灌胃一周后,永久性结扎LAD。术后24 h,检测小鼠心室的心肌梗死面积、缺血危险区比例,以及血清LDH含量。2.细胞培养将MCM心肌细胞接种至含10%胎牛血清的DMEM培养基中,添加姜黄素(10μM)或等量DMSO常规条件下孵育2h后,置于含氧量为20%或0%的37℃恒温培养箱中培养。3.细胞转染与分组使用Lipofectamine 2000转染miR-7a inhibitor或对照scrambled siRNA序列至MCM细胞,进行miR-7a干扰；转染pcDNA-SP1或对照pcDNA空质粒,进行SP1过表达。转染48 h后,姜黄素预处理2h,再缺氧处理24 h。4. Real-time PCR检测miR-7a的表达水平提取心肌组织和细胞中的总RNA后,进行miR-7a特异性反转录。以U6作为内参照,使用miR-7a和U6特异性探针,实时定量PCR检测miR-7a的表达水平。5. Real-time PCR检测SP1 mRNA的表达水平提取心肌组织和细胞中的总RNA后,逆转录合成cDNA。以β-actin为内参基因,实时定量PCR检测SP1 mRNA的表达水平。6. Western blot检测SP1的蛋白表达水平用RIPA蛋白裂解液提取组织或细胞蛋白,使用特异性抗体,检测SP1的蛋白表达水平。7. Caspase-3活性检测使用Caspase-3分光光度法检测试剂盒,检测各组MCM细胞的caspase-3活性。8.细胞凋亡检测使用TUNEL凋亡检测试剂盒,检测各组MCM细胞中的细胞凋亡比例。研究结果1.姜黄素对心梗后心肌损伤和miR-7、SP1表达水平的影响姜黄素给药可以显著降低MI小鼠的心肌梗死面积、缺血危险区比例和血清LDH含量,减弱MI引发的心肌细胞损伤。同时,姜黄素可以分别上、下调MI小鼠心肌组织中miR-7a、SP1的表达水平。2.姜黄素对缺氧诱导的MCM细胞凋亡的影响姜黄素预处理可以显著降低缺氧诱导的caspase-3活性升高和凋亡细胞比例增加,减少缺氧诱导的MCM细胞凋亡。同时,缺氧可以分别下、上调miR-7a、SP1的细胞表达水平,而姜黄素预处理可以进一步逆转miR-7a、SP1的异常表达趋势,抑制缺氧诱导的miR-7a表达降低和SP1表达升高。3. miR-7a或SP1对姜黄素抑制缺氧诱导的细胞凋亡的影响姜黄素对缺氧诱导的caspase-3活性升高和凋亡细胞比例增加的抑制作用,均可被miR-7a干扰或SP1过表达逆转。4. miR-7a干扰可以取消姜黄素对缺氧诱导的SP1表达增加的抑制作用姜黄素对缺氧诱导的SP1表达增加的抑制作用,也可被miR-7a干扰逆转,提示miR-7a通过调控SP1的表达参与姜黄素的心肌保护作用调控。研究结论1.miR-7a可以调控缺氧诱导的SP1表达变化2.姜黄素通过抑制缺氧诱导的miR-7a表达降低,进一步抑制SP1的表达增加,从而保护心肌细胞避免心梗后的心肌损伤和缺氧诱导的细胞凋亡。