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目的:本试验采用小鼠肺癌肿瘤模型为研究对象。取小鼠骨髓细胞体外培养树突状细胞(Dendritic cell,DC),用肿瘤抗原活化DC成熟,与小鼠脾淋巴细胞诱导的淋巴因子激活杀伤细胞(Lymphokine activated killer cell,LAK)细胞共培养,观察共培养细胞的抗肿瘤能力及回输体内后的组织器官分布特点。为今后在临床联合应用DC和LAK细胞治疗肺癌提供试验依据。方法:1培养小鼠肺癌肿瘤细胞株Lewis lung carcinoma(LLC),收集对数生长期的LLC细胞,调节细胞浓度为1×107/ml。以C57BL/6小鼠右侧前肢腋下为注射部位,皮下注射单细胞悬液0.2ml,以建立小鼠肿瘤模型。2取小鼠肿瘤组织,应用反复冻融法制备肿瘤抗原,使用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒进行LLC肿瘤抗原蛋白定量。3 DC与LAK细胞的体外培养。从C57BL/6小鼠胫骨与股骨获得骨髓细胞,用含有rmGM-CSF 50ng/ml和rmIL-4 25ng/ml的RPMI1640培养基培养,隔天半量换液,并加相应细胞因子。培养至第七天的DC,加入LLC肿瘤抗原100mg/ml,48h后,收获悬浮细胞,为活化DC。使用流式细胞仪检测CD80、CD86的表达情况。于C57BL/6小鼠获得脾脏,过400目钢网制备脾细胞悬液。利用梯度离心法收获脾淋巴细胞。用含rmIL-2 1000iu/ml的RPMI1640培养基培养至第七天,收获细胞为LAK细胞。4 DC-LAK的共同培养。收获的活化DC与LAK细胞,按1:5的比例混合,加入rmIL-2 500iu/ml、rmGM-CSF 25ng/ml、rmIL-4 12.5ng/ml培养48h后收集,为共培养DC-LAK细胞。5共培养DC-LAK体外杀伤实验。效应细胞为LAK细胞组和与肿瘤抗原致敏DC共培养LAK细胞(DC-LAK),靶细胞为LLC细胞,分别按效靶比20:1、40:1的条件下用MTT法检测两种细胞的杀伤活性。6回输外源性杀伤细胞。荷瘤C57BL/6小鼠48只,于注射LLC后10天,回输经CFSE标记的外源性杀伤细胞。荷瘤小鼠随机分为瘤旁皮下注射和腹腔注射2组,各组再随机分为DC-LAK组与LAK组,各组再随机分为4组(1h、4h、24h、72h),每组3只,每只分别经瘤旁皮下注射或腹腔注射CFSE标记的DC-LAK细胞或LAK细胞3×107/0.2ml。7外源性杀伤细胞体内分布的检测。各组荷瘤小鼠分别于回输外源性杀伤细胞后1h、4h、24h、72h,取外周血、肝脏、脾脏、肺脏与肿瘤。肝脏、脾脏、肺脏与皮下肿瘤过200目钢网,加入与原重量相等的PBS重悬。外周血按体积用PBS1:1稀释。处理好的血,肝脏,脾脏,肺脏与皮下肿瘤各样本取10μl,滴于载玻片上,上覆盖玻片,每个样本滴片3张。激光共聚焦荧光显微镜(Laser scanning confocal microscope,LSM)下观察成像(激发波长为488nm,荧光信号的检测通道为505nm的长通滤光片)。于400倍视野下观察,每张玻片随机选取10个视野,采集图像,计数图像中绿色荧光细胞。以3张玻片均数记为该样本阳性细胞数。结果:1小鼠骨髓细胞培养9天后表面突起多样化,细胞呈树突状。平均每只小鼠收获DC6×106个。经LLC肿瘤冻融抗原活化的DC,其表面CD80表达率为42.4%,CD86表达率为75.31%,CD80CD86共表达率为41.36%。2 DC和LAK细胞混合培养48h后形成DC-LAK细胞簇,少则数个细胞,多则数十个细胞。3外源性杀伤细胞对小鼠LLC肺癌细胞的体外杀伤活性。效应细胞与靶细胞为40:1时,单纯LAK细胞组杀伤活性为(63.45±2.46%),而经LLC细胞抗原致敏的DC能诱导出LAK细胞对LLC肺癌细胞更强的杀伤活性(81.02±2.18%)。两者相比较差异有显著性(p<0.01)。当效应细胞与靶细胞为20:1时,DC-LAK细胞对LLC细胞的杀伤活性(75.10±3.68%)仍明显高于LAK细胞的杀伤活性(57.92±2.11%)(p<0.01)。4外源性杀伤细胞回输荷瘤小鼠体内的分布。(1)外源性杀伤细胞经腹腔注射途径回输荷瘤小鼠体内后,标记的DC-LAK细胞于回输后1h时,在肺脏内的分布达到峰值;4h时,肝脏和脾脏内的分布达到峰值;24h时,肿瘤内的分布达到峰值,此时肿瘤内的分布高于其他脏器(p<0.05)。72h时,此时脾脏内分布最多(p<0.05)。在整个观测过程中,外周血中的分布始终很低。与LAK细胞组相比,在1h、4h、24h时肿瘤内的分布DC-LAK组高于LAK组(p<0.05)。在72h时肿瘤内的分布两组无统计学差异。(2)外源性杀伤细胞经瘤旁皮下注射途径回输荷瘤小鼠体内后,标记的DC-LAK细胞于回输后1h时,在肺脏内的分布达到峰值;4h时,肝脏内的分布达到峰值;24h时,肿瘤脾脏内的分布达到峰值,此时肿瘤内的分布高于其他脏器(p<0.05)。72h时,肿瘤脾脏内分布最多。在整个观测过程中,外周血中的分布始终很低。与LAK细胞组相比,在1h、4h、24h时肿瘤内的分布DC-LAK组高于LAK组(p<0.05)。在72h时肿瘤内的分布两组无统计学差异。(3)两种回输途径回输的比较。腹腔注射途径回输荷瘤小鼠体内后,DC-LAK细胞主要分布于肝脏和脾脏中;瘤旁皮下注射途径回输荷瘤小鼠体内后,DC-LAK细胞主要分布于肿瘤中。在各观测时间点,DC-LAK细胞在肿瘤内的分布瘤旁皮下注射组均高于腹腔注射组(p<0.05)。结论:1小鼠骨髓细胞体外联合应用rmGM-CSF和rmIL-4培养,经肿瘤细胞冻融抗原致敏,可以诱导扩增出较多数量、较高纯度的树突状细胞,可满足一般试验的要求。2肿瘤冻融抗原致敏DC诱导的LAK细胞对小鼠LLC细胞具有高效的特异性杀伤作用。3 DC-LAK细胞经腹腔注射途径回输荷瘤小鼠体内后,主要分布于肝脏和脾脏中;经瘤旁皮下注射途径回输荷瘤小鼠体内后,主要分布于肿瘤组织中。DC与LAK细胞共培养后经两种途径回输荷瘤小鼠体内后,均可提高LAK细胞于肿瘤组织内的分布;在各观测时间点,DC-LAK细胞在肿瘤内的分布瘤旁皮下注射组均高于腹腔注射组。