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猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)、猪流行性乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)、猪圆环病毒 2 型(Porcine Circovirus Serotype 2,PCV2)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)是引起猪繁殖障碍性疫病的主要病原。这几种病原可导致相似的发病症状,临床上常常难以区别。因此,建立一种同步鉴别这几种猪繁殖障碍性疫病的检测方法是生产中亟待解决的问题。本研究以CSFV、HP-PRRSV、JEV、PCV以及PRV为研究对象,通过金标银染显色技术,构建了一套能够同步鉴别这五种猪繁殖障碍性疫病的可视化基因芯片检测技术。通过优化可视化基因芯片制备和检测过程中的条件,建立起了标准化的可视化基因芯片检测技术,并在此基础上,对其进行质量评价以及临床初步应用评价。主要研究内容如下:1.靶基因引物及寡核苷酸探针的设计本研究在前期研究的基础上,针对CSFV的E0保守基因;HP-PRRSV的Nsp2保守基因;JEV的PrM/M保守基因;PCV的ORF2保守基因以及PRV的gB保守基因分别合成设计特异性引物。根据各个靶基因扩增产物的内部核酸序列分别设计1条或者2条长度约为45bp的寡核苷酸探针,并在其5’端添加15个T碱基作为连接臂,同时进行氨基化修饰。2.可视化共检基因芯片的构建与条件优化研究(1)不对称PCRr扩增标记技术通过优化上游引物和下游引物的浓度比例,进行靶基因的不对称PCR扩增标记,获得大量生物素标记的单链靶基因。结果发现,当CSFV-E0基因的上游引物与下游引物的浓度比为1:8时,靶基因单链产物最多;而JEV-PrM/M、PRRSV-Nsp2、PCV-ORF2及PRV-gB基因的上游引物与下游引物的浓度比为1:6,靶基因单链产物最多。(2)可视化共检基因芯片的制备利用Baio(?)点样缓冲液和ddH20稀释以上各个寡核苷酸探针,将其终浓度调整为50μmol/L。按照预先设计的芯片阵列,利用晶芯(?)SmartArrayerTM16的喷样系统将寡核苷酸探针点制到醛基基片上。1次喷样结束后,紫外交联5min,将醛基基片置于37℃环境条件下水化过夜,使用0.5%NaBH4封闭30min。经过洗涤程序后,自然干燥,4℃保存备用。(3)可视化基因芯片的条件优化研究通过探索和优化可视化基因芯片制备及其检测过程中的条件,确定了标准化的可视化基因芯片检测技术:探针浓度为50μmol/L,进行1次喷样,即可制备质量较好的芯片;在45℃杂交温度下杂交120min;加入200pL20倍稀释的Streptavidin-nangold(浓度为4μg/mL),在37℃环境条件下孵育30min;在避光条件下,银染显色6-8min,即可用肉眼观察结果。3.可视化基因芯片检测技术的评价本研究对可视化基因芯片进行特异性、灵敏性和稳定性试验,并将其初步应用于临床样本检测,比较其与PCR/RT-PCR临床样品检测结果的一致性。(1)可视化基因芯片的质量评价分别以 CSFV、HP-PRRSV、LP-PRRSV、JEV、PCV2、PRV 以及 PPV 为模板,进行靶基因的扩增标记,标记产物与芯片进行杂交,评价其特异性;将重组质粒DNA,分别进行10×梯度倍比稀释,将其作为模板进行靶基因的扩增标记,与芯片杂交后,评价其灵敏性;将同一批次制备的芯片,在4℃环境条件下分别保存15天、30天、45天、60天后,取出与靶基因进行杂交,评价其稳定性。结果表明,CSFV、HP-PRRSV、JEV、PCV2、PRV单独杂交时只在芯片相应位置出现黑色银染信号,LP-PRRSV和PPV杂交结果则呈阴性,各个探针之间没有相互干扰;芯片最低检测浓度为25.0pg/μl;芯片在4℃环境条件下保存60天仍可进行有效检测。(2)可视化基因芯片的初步临床应用本研究应用所构建的芯片对四川绵阳、郫县、宜宾、邛崃、新津、名山、北川、崇州、潼南、洪雅、安岳等地区的113份临床送检样本进行检测。提取病死猪的肝脏、肺脏、肾脏、脾脏等组织的基因组RNA和DNA,RNA病毒经反转录成cDNA后,分别以cDNA/DNA为模板进行不对称PCR扩增标记后与可视化基因芯片杂交检测,比较其与PCR/RT-PCR检测结果的一致性。结果表明:以PCR/RT-PCR作为方法对照,可视化基因芯片的特异性为100%,灵敏性为84%～100%,两种检测方法的符合率高于96.5%。说明本研究所构建的可视化基因芯片可对用于猪临床样本的检测。