卵巢颗粒细胞能产生类固醇激素调控生理机能,在卵泡的生长发育中发挥着重要的作用;相应的,卵巢颗粒细胞凋亡可引起卵泡的闭锁,在女性围绝经期的生殖能力衰老中扮演着重要的角色。现代研究已经表明:氧化应激在诱导衰老的诸多因素中占主要地位,而处于围绝经期的妇女伴随着衰老相关的生育能力下降很可能是由氧化应激调控所致。因此,缓解卵巢颗粒细胞的氧化应激损伤/提高卵巢颗粒细胞的活性,成为临床上治疗女性生殖衰老疾病的重要方向。哈蟆油是一种用于治疗女性围绝经期综合征、延缓女性衰老的传统中药,富含多种生物活性物质。现代药理研究表明,哈蟆油可以提高模型大鼠体内雌激素水平、上调抗氧化因子的表达、促进卵泡的发育、改善卵巢功能;体外研究表明,哈蟆油可促进卵巢颗粒细胞的增殖,但哈蟆油对卵巢保护的分子机制仍未阐明。本研究通过H2O2诱导建立体外卵巢颗粒细胞氧化应激损伤模型,研究哈蟆油含药血清对卵巢颗粒细胞的保护作用和潜在的分子机制;探索中药治疗作用靶点,为临床应用提供理论依据。目的:体外建立原代大鼠卵巢颗粒细胞培养体系,探讨哈蟆油含药血清对H2O2诱导的大鼠卵巢颗粒细胞氧化应激损伤的保护作用及分子机制。方法:1.建立大鼠卵巢颗粒细胞原代培养体系和运用CCK-8法检测哈蟆油含药血清对卵巢颗粒细胞增殖的影响,分析哈蟆油含药血清作用于卵巢颗粒细胞的最佳浓度和时间。2.以H2O2诱导建立体外大鼠卵巢颗粒细胞氧化应激模型,采用CCK-8法检测哈蟆油含药血清对H2O2诱导卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用。3.DAPI染色观察哈蟆油含药血清对H2O2诱导卵巢颗粒细胞凋亡的形态学特征。进一步采用流式细胞仪分析卵巢颗粒细胞凋亡率、活性氧(ROS)和线粒体膜电位(ΔΨm)水平。4.采用qRT-PCR和Western blot法检测卵巢颗粒细胞中凋亡相关基因和蛋白(p53、Bax、Bcl-2、caspase-3)及MAPK信号通路相关基因和蛋白(ERK1/2、JNK、p38 MAPK)的表达水平。结果:1.原代培养大鼠卵巢颗粒细胞,经免疫荧光鉴定,卵巢颗粒细胞纯度超过90%。2.CCK-8检测结果表明,哈蟆油含药血清可显著提高卵巢颗粒细胞增殖能力,有一定的量效和时效关系,随着哈蟆油含药血清浓度的增加,其促增殖能力逐渐增强,在作用48 h后,20%浓度体积分数的哈蟆油含药血清组最为显著(P<0.05)。3.卵巢颗粒细胞暴露于不同浓度的H2O2后,其活性呈剂量依赖性下降,其中H2O2浓度为150μM,作用时间为2 h,细胞存活率下降为51.18%±8.07%(P<0.01),因此选定H2O2诱导卵巢颗粒细胞氧化应激损伤的适宜浓度为150μM。不同浓度的哈蟆油含药血清预处理卵巢颗粒细胞48 h后经H2O2作用2 h,与模型组相比,哈蟆油含药血清组的卵巢颗粒细胞活力升高(P<0.01)。4.DAPI染色结果显示,卵巢颗粒细胞经H2O2作用2 h后,可见细胞核染色质固缩、浓集,核碎裂和凋亡小体形成等凋亡形态特征,预处理哈蟆油含药血清可显著减少DAPI阳性凋亡细胞数目,进一步采用Annexin V/PI结合流式细胞术定量分析细胞凋亡率,发现哈蟆油含药血清可显著减少卵巢颗粒细胞凋亡率。5.DCFH-DA和罗丹明123染色结合流式细胞仪分析结果显示,哈蟆油含药血清不仅可以减少H2O2诱导卵巢颗粒细胞内ROS累积,而且可以提高线粒体膜电位水平,显著抑制H2O2诱导的卵巢颗粒细胞线粒体膜电位去极化。6.qRT-PCR检测结果表明,经H2O2刺激卵巢颗粒细胞2 h后,与模型组比较,哈蟆油含药血清组均能显著增加细胞中ERK1/2、Bcl-2基因的表达(P<0.05)和降低细胞中p53、Bax、caspase-3、JNK、p38 MAPK基因的表达(P<0.05)。7.Western blot检测结果显示,卵巢颗粒细胞经H2O2处理2 h后,促凋亡相关蛋白p53、Bax、caspase-3的表达显著上升,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降。然而,经哈蟆油含药血清预处理后可显著下调p53、Bax、caspase-3的表达和上调Bcl-2的表达,并且进一步检测哈蟆油含药血清对MAPK信号通路相关蛋白发现,哈蟆油含药血清可抑制JNK和p38 MAPK的磷酸化,促进磷酸化ERK1/2的表达。结论:1.优化原代大鼠卵巢颗粒细胞的分离方法,获得量多、纯度高的卵巢颗粒细胞,为下一步深入研究哈蟆油等中药对卵巢的作用和机制奠定基础。2.哈蟆油含药血清能对抗H2O2诱导的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡,对卵巢颗粒细胞具有一定的保护作用,其机制可能涉及减少细胞内ROS产生,抑制线粒体膜电位的去极化以及下调增殖负性调控因子的表达,激活MAPK信号通路。