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近年“食品中耐药细菌的危险性”引起重视,关于食源致病菌的耐药性的研究增多,有研究表明产肠毒素和具有抗药性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,简称SA)已在食品中广泛存在,尤其养殖业中大量使用抗生素,动物性食品极易成为耐药细菌的“蓄水池”。因此本实验从四川省7个地方采集了猪肉、牛奶、牛肉、鸡肉和鸡蛋等动物性食品样品,以分析其中SA的污染情况,调查四川动物性食品源SA的耐药性,并建立多重PCR方法快速检测SA对β-内酰胺类抗生素的耐药基因,侧重检测耐甲氧西林的SA(MRSA)。1.动物性食品源SA的分离鉴定自2006年12月至2007年9月共采集样品2560份,参照GB和《葡萄球菌属细菌生化鉴定编码(TH-16S)》,利用选择性培养基和生化实验等常规方法对SA进行了分离鉴定。用Baird-Parker平板初步筛选分纯获得疑似菌株118株,根据科玛嘉SA显色平板菌落特征,涂片染色镜检,溶血现象和血浆凝固酶等实验结果,依GB判定其中108株为SA,依据TH-16S中葡萄球菌双歧索引判定,凝固酶阳性的113株均为SA,而依据16项生化实验结果仅有76株菌株鉴定为SA。从污染情况来看,生牛奶中的分离率最高(10.54%),其次是猪肉(7.11%)、鸡肉(4.12%),蛋样中SA的分离率很低。四川地区动物性食品源SA的生化表型复杂且存在一定差异,常规的表型分析具有一定缺陷。各个地方各类样品中SA污染情况有一定差异,与其它报道相比,四川省生肉、生奶和鲜蛋中SA的分离率较低。2.动物性食品源SA的耐药性分析采用美国临床实验标准委员会(NCCLS)推荐的肉汤微量稀释法,对凝固酶阳性的113株SA进行了25种临床常用抗生素(组合)的敏感性实验。结果:SA对青霉素G(93.81%)、氨苄西林(92.92%)、甲氧苄啶(92.92%)和磺胺异噁唑(88.5%)的耐药率很高,对林可霉素、红霉素、阿奇霉素和四环素耐药率在41.59%～47.79%;对庆大霉素、卡那霉素、替米考星的耐药率在21.24%～29.20%;对氯霉素、达氟沙星和环丙沙星耐药率较低(2.65%～7.08%);所有菌株均对苯唑西林,头孢类(先锋唑啉、头孢曲松、头孢噻呋),阿米卡星,强力霉素,喹诺酮类(恩诺沙星、洛美沙星、诺氟沙星)敏感;共产生了47种耐药谱;SA可耐受药物的种数最少2种;主要对青霉素类、磺胺类和大环内酯类表现出多重耐药。四川省动物性食品源SA耐药情况与其它地区的差异不明显,没有检测出MRSA。研究结果可以作为兽医用药的参考,也为食品源SA耐药性的安全评价提供了依据。另外,113株凝固酶阳性SA中49.56%的菌株表现出β-内酰胺酶活性。对68株多重耐药的菌株进行了苯唑西林(OXA)梯度浓度药物诱导,当药物浓度达5μg/mL时,获得8株耐药菌SCI1～SCI8。用含有6μg/mL OXA的4%NaCl的M-H平板进行检测,结果获得了3株疑似MRSA,分别是SCI3、SCI6和SCI8,有待通过基因分析验证。3.PCR方法的建立与应用根据在GenBank中注册的SA的耐热核酸酶基因nuc,β-内酰胺酶基因blaZ和甲氧西林耐药基因mecA,利用Primer 5设计了3对特异性引物,通过实验条件的优化成功建立了分析SA耐β-内酰胺类抗生素的耐药性的三重PCR方法,可以在一次PCR反应中扩增出相应的229bp(nuc)、787bp(blaZ)和1459bp(mecA)的目的片段。应用这套多重PCR方法对从样品中分离的79株菌株进行了检测。结果:97.47%的菌株nuc阳性,73.42%的blaZ阳性,均无mecA检出;与常规的包括耐热核酸酶和凝固酶在内的鉴定方法的符合率达97.47%,与生化鉴定的符合率为75.95%;blaZ扩增结果与β-内酰胺酶实验和对青霉素类的敏感性分析结果的符合率分别为62.34%和77.92%,三结果同时符合的比率为50.65%。多重PCR分析结果为今后食源SA的鉴定和耐药性快速分析提供了参考。对8株经过OXA诱导的菌株(SCI1～SCI8)进行了多重PCR检测。原始株SCI6 nuc+、blaZ+、mecA-,而8、10、12、16μg/mL OXA诱导后的菌株SCI6-8、SCI6-10、SCI6-12、SCI6-16均nuc-、blaZ-、mecA+,诱导株可能通过OXA诱导获得了耐药基因mecA,为进一步研究食源SAmecA基因的获得和MRSA的遗传背景提供了很好的材料,诱导株nuc和blaZ的“缺失”或“变异”和mecA的来源还有待进一步研究证实。其它7株菌诱导前后扩增结果相同。对标准菌ATCC33591的nuc、blaZ、mecA PCR产物和SCI6-8的mecA PCR产物进行了克隆及序列测定,片断大小均与软件设计的相应片断大小一致。对基因序列和相应氨基酸序列比对分析表明同源性很高。将测定的序列在GenBank中注册,序列号分别为:FJ809757、FJ809758、FJ810876和FJ810877。