乳腺癌是临床上女性最为常见的恶性肿瘤之一。有研究表明乳腺癌干细胞有自我更新、分化、免疫逃逸、治疗抵抗的干性特征,是乳腺癌预后不良的关键因素,肿瘤干细胞干性功能的实现和维持需要一个适应的微环境(niche)。靶向肿瘤干细胞微环境可以抑制肿瘤干细胞的干性,从而实现减少肿瘤复发、改善肿瘤患者预后。乳腺癌组织中有丰富的间质成纤维细胞(CAFs)。近年来越来越强调不能“孤立”地看待肿瘤细胞,在乳腺癌的研究中,将CAF细胞与乳腺癌细胞共培养的条件下,模拟乳腺癌在体内的生长环境来分析乳腺癌细胞的生物学行为以及对药物的反应。自噬是非常重要的生物学现象。肿瘤组织中的缺氧、缺营养状态和一些细胞因子、药物常常诱发细胞发生自噬,并且参与了肿瘤细胞的发生和进展,但是在肿瘤微环境中关于自噬的研究还罕有报道,肿瘤微环境中构成细胞同样在肿瘤组织特殊环境下。近年来,研究发现自噬与肿瘤干细胞关系密切,肿瘤干细胞依赖自噬来维持生存和干性功能,同时在乳腺癌组织中发现乳腺癌干细胞常常分布在缺营养和乏氧区域,与乳腺癌细胞一样,CAF细胞也处于自噬激活的环境中。有学者在CAF细胞中观测到自噬现象,但CAF细胞出现自噬的机制及意义尚不清楚。CAF细胞是乳腺癌干细胞(BCSCs)niche的重要构成细胞,研究CAF细胞自噬状态及机制对niche的调控网络的分析有重要意义。自噬一般指“巨自噬”,即通过自噬体和溶酶体的融合,来实现对损伤蛋白和细胞器的分解和再利用。新近发现自噬还有一种非经典途径,即自噬性分泌,自噬体利用囊泡样结构进行蛋白的运输和分泌,这些蛋白无前导序列,无法通过高尔基-内质网系统进行分泌,需要借助自噬囊泡来实现转位和泌出,HMGB1就是其中之一的蛋白。理论上肿瘤微环境中的CAF细胞通过自噬性分泌途径可调控乳腺癌细胞,但目前尚未有此方面的报道。本论文从体内、体外观测、分析了乳腺癌间质CAF细胞的自噬标志蛋白表达特点和CAF细胞自噬对乳腺癌细胞干性的调控作用及对乳腺癌细胞成瘤能力的影响。旨在通过观察分析乳腺癌间质CAF细胞的自噬,筛选自噬性分泌的效应蛋白和调控乳腺癌细胞的机制,为乳腺癌的诊治提过新的理论支持和治疗策略。主要结果和结论如下:一.乳腺癌间质成纤维细胞(CAF)LC3B的高表达与ALDH1A1阳性的乳腺癌干细胞及乳腺癌不良预后相关。1.413例手术切除的浸润性乳腺癌患者标本中检测自噬标志蛋白LC3B表达,免疫组化染色结果显示在乳腺癌样本CAF细胞有一定比例阳性表达(36.7%)。2.统计分析显示,在ER阳性乳腺癌中,CAF细胞LC3B高表达组的总体生存率显著低于低表达组,与LC3B在乳腺癌中的表达情况无关(P<0.05)。3.对不同LC3B免疫组化染色的4组的乳腺癌的复发率进行分析。结果显示CAF细胞LC3B高表达组(无论乳腺癌细胞LC3B的表达情况)其复发率均为最高。二.CAF细胞的自噬状态影响了乳腺癌细胞的干性及乳腺癌细胞的成瘤能力。1.我们分离培养了乳腺癌原代的CAF细胞,并根据自噬基因(Atg)的表达的不同,依次分为CAF1,CAF2和CAF3。不同的CAF细胞给予饥饿处理后,其培养上清(CAF-CM)处理乳腺癌细胞,结果显示CAF3(自噬基因表达最高的CAF)对ER阳性乳腺癌细胞系的ALDH1阳性细胞的富集作用最强;但在ER阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的检测中,没有相似的结果。2.CAF-CM能显著增强乳腺癌细胞MCF-7的干性转录因子基因和蛋白水平的表达,在CAF的自噬启动基因(ATG5)被敲低后,CAF-CM对乳腺癌细胞的这种增强作用显著下降。CAF-CM对乳腺癌细胞MCF-7的干细胞(ALDH1阳性细胞)的富集作用,同样在自噬基因ATG5被敲低后,这种乳腺癌干细胞富集作用也显著下降。3.用CAF-CM处理乳腺癌细胞MCF-7,其成球能力也受CAF的自噬状态的调控;在CAF细胞和MCF-7细胞混合注射的小鼠成瘤实验中,显示CAF-shATG5+MCF-7组的成瘤能力显著低于CAF-sh NC+MCF-7组。4.乳腺癌组织中免疫组化双染色显示ALDH1A1阳性的乳腺癌细胞周围的CAF细胞常常LC3Ⅱ阳性(75%)。三.CAF细胞自噬促进了HMGB1分泌到胞外。1.我们对可能参与乳腺癌细胞调控的蛋白HMGB1,IL-1β和IL-18进行ELISA检测。在CAF-CM中,HMGB1的浓度较高,而IL-1β和IL-18未检测到。2.在不同的CAF细胞的条件培养上清中检测HMGB1浓度,结果显示在自噬基因表达最高的CAF3-CM中HMGB1的浓度最高。3.免疫荧光染色显示在饥饿处理后CAF细胞的HMGB1逐渐从细胞核转位到胞浆,并逐渐减弱(出胞)。4.免疫荧光双标显示在饥饿处理后CAF细胞中胞核的HMGB1表达减弱,并与自噬囊泡的蛋白LC3Ⅱ有共定位表达。5.为进一步验证HMGB1的分泌途径,自噬基因ATG5被敲低后其条件培养上清(CAF-sh ATG5-CM)中的HMGB1浓度显著下降(P<0.05*)。四.CAF是ER阳性乳腺癌组织中胞外HMGB1的主要来源。1.MCF-7细胞上清中的HMGB1浓度显著低于CAF细胞上清。2.WB实验显示给予饥饿处理(激活自噬)后,CAF细胞和MCF-7细胞的LC3Ⅱ蛋白表达均有增高(LC3Ⅱ增高显示自噬体形成),但CAF细胞的P62蛋白表达有一定量增多,而MCF-7细胞的P62蛋白表达明显下降(P62蛋白在形成自噬溶酶体时,被溶酶体降解),这个结果提示CAF细胞和MCF-7细胞自噬激活后有所不同,及乳腺癌细胞MCF-7自噬激活后以自噬性降解为主,而CAF细胞自噬激活后,可能以非经典自噬(自噬性分泌)为主。3.自噬体示踪实验(感染AD-LC3Ⅱ-GFP-ERPF)显示乳腺癌细胞MCF-7的自噬激活后主要形成自噬浓度溶酶体(红色荧光斑点),CAF细胞自噬激活后则可见大量的自噬体(黄绿色荧光斑点),结果进一步证实乳腺癌细胞MCF-7自噬激活后以自噬性降解为主,而CAF细胞自噬激活后以非经典自噬(自噬性分泌)为主。4.WB实验显示给予饥饿处理(自噬激活)后,乳腺癌细胞MCF-7胞内的HMGB1明显低于CAF细胞。5.人乳腺癌组织连续切片显示,乳腺癌间质CAF细胞胞内的HMGB1的表达与LC3Ⅱ的表达成反比,即在LC3Ⅱ高表达(自噬激活)时,HMGB1低表达;而在LC3Ⅱ低表达(自噬未激活)时,HMGB1高表达。6.用CAF-CM处理MCF-7细胞,则ALHD1阳性的MCF-7显著增多,而用MCF-7-CM处理MCF-7细胞,则ALHD1阳性的MCF-7数量无显著变化。此结果也符合胞外HMGB1主要来自CAF。五.肿瘤微环境中胞外HMGB1促进维持乳腺癌细胞干性.1.乳腺癌细胞MCF-7被HMGB1处理后,干性转录因子OCT4、SOX2、NANOG的基因表达水平和蛋白表达水平均增高。2.外源性加入HMGB1后,乳腺癌细胞MCF-7的成球能力增强,并且ALDH1阳性的MCF-7的数量增多。3.为验证CAF细胞通过分泌HMGB1促进乳腺癌细胞干性,我们在MCF-7和CAF--CM共培养时,外源性加入GL(HMGB1的拮抗剂),结果显示CAF对MCF-7的干性富集作用被GL抵消。4.MCF-7和CAF混合注射移植瘤实验,外源性加入GL(10 mg/kg/day),结果显示CAF对MCF-7的成瘤促进作用被GL抵消。收取移植瘤后,在GL处理组的肿瘤组织中免疫组化检测ALDH1A1阳性率显著低于对照组。六.TLR4(HMGB1受体)是CAF细胞调控乳腺癌细胞干性的关键分子。1.在TCGA数据库,乳腺癌组织中TLR2、TLR4、TLR9、RAGE(HMGB1的受体)的基因表达分析显示,TLR4与乳腺癌干细胞标记ALDH1A1的表达显著正相关(r2=0.5973,p<0.001),并且明显高于其他3个配体。2.使用LPS(TLR4的外源性激活物)处理乳腺癌细胞MCF-7,MCF-7的ALDH1阳性的细胞比例显著增高。3.TAK-242(TLR4的拮抗剂)可明显抑制HMGB1对乳腺癌干细胞的富集作用,并且能降低CAF-CM对MCF-7的干性转录因子Oct4、Sox2、Nanog蛋白表达的促进作用。4.流式分选TLR4阳性的MCF-7细胞,其成瘤率(60%)显著高于TLR4阴性的MCF-7细胞(0%);当混合CAF细胞后,TLR4阳性的MCF-7细胞成瘤率增高为100%,并且成瘤大小也显著增大,而对TLR4阴性的MCF-7细胞的成瘤能力无促进作用。七.LC3II/TLR4联合检测可作为乳腺癌临床预后检测指标。1.在303例ER阳性乳腺癌组织中检测CAF细胞LC3II表达和乳腺癌细胞TLR4表达,145例(47.9%)乳腺癌细胞TLR4高表达,158例(52.1%)CAF细胞LC3II高表达。2.CAF细胞LC3II高表达组的乳腺癌总生存期(P=0.018*)和无复发生存期(P=0.021*)显著低于CAF细胞LC3II低表达组;乳腺癌细胞TLR4高表达组的乳腺癌总生存期(P=0.060)和无复发生存期(P=0.025*)低于乳腺癌细胞TLR4低表达组,在TCGA数据库中,检测乳腺癌细胞TLR4高表达组在样本量增加后总生存期显著低于乳腺癌细胞TLR4低表达组(n=604,P<0.05*)。3.联合检测LC3II-TLR4,LC3II/TLR4高表达组的总生存期和无复发生存期显著低于LC3II/TLR4低表达组(P<0.01**);COX多因素分析显示LC3II/TLR4联合检测可作为一个新的乳腺癌预后指标(总生存分析HR=7.059,95%置信区间=1.126-44.245,P=0.037*;无复发生存分析HR=2.735,95%置信区间=1.111-6.6.734,P=0.029*)。。CAF细胞LC3Ⅱ和乳腺癌细胞TLR4联合检测这用于临床评估ER阳性乳腺癌预后,并可用于指导临床治疗。