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猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要特征的传染病。本研究采用重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extension, SOEing)构建出两个含有PRRSV GP5和GP4优势抗原表位核苷酸片段的多表位串联基因,分析其真核表达重组质粒和原核表达产物在小鼠诱导的免疫反应。 采用SOEing PCR的方法将编码GP5的aa29～60和GP4的aa33～70核苷酸片段进行拼接,获得两个编码双表位多串联基因E54-2和E54-4。将E54-2和E54-4基因分别克隆至pcDNA3.1(+),构建出真核表达重组质粒pcDNA3-E54-2、pcDNA3-E54-4。采用SOEing PCR将E54-2基因与猪泛素基因(Ubiquiten)融合,获得融合基因Ub-E54-2,构建出真核重组表达质粒pcDNA3Ub-E54-2。将3种真核重组质粒分别转染COS7细胞,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4分别转染P815细胞,间接免疫荧光试验表明,重组质粒在哺乳动物细胞中能瞬时和稳定表达目的蛋白E54-2和E54-4。 将E54-2和E54-4基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建原核表达重组质粒pGEX-6P-E54-2和pGEX-6P-E54-4,经在大肠杆菌中诱导表达,蛋白表达量分别为40%和30%。采用包涵体洗涤和电洗脱纯化重组蛋白GST-E54-2和GST-E54-4。Western-Blotting分析结果表明,重组蛋白可与猪源PRRSV阳性血清和鼠源的抗GP4和GP5血清发生特异性反应。 用3种真核表达重组质粒分别免疫小鼠,结果表明,3种真核表达重组质粒均能诱导体液免疫反应,产生特异性的抗GP4、GP5和多表位串联肽抗体。在首免后第28天,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4免疫组和对照组之间抗GP5抗体水平差异显著(p<0.05);首免后第49天,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4免疫组之间抗GP5抗体差异显著(p<0.05);在首免后第28天,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4免疫组和对照组之间抗GP4抗体水平差异显著(p<0.05)。4免后3周,pcDNA3-E54-2免疫组中和抗体效价为1:16,pcDNA3-E54-4免疫组中和抗体效价为1:28。 用纯化的融合蛋白GST-E54-2、GST-E54-4和表达GST-E54-2和GST-E54-4融合肽的基因工程全菌体分别免疫小鼠。经ELISA检测结果表明,在3免后1周,E54-2全菌免疫组和纯化蛋白免疫组抗GP4和GP5抗体效价分别为1:1,600和1:3,200;E54-4全菌免疫组和纯化蛋白免疫组抗GP4抗体效价为1:3,200,抗GP5抗体效价分别为1:12,800和1:6,400。中和抗体检测结果表明,在3免后1周,E54-2全菌免疫组和纯化蛋白免疫组抗体效价分别为1:22.2和1:19.9;E54-4全菌免疫组和E54-4纯化蛋白免疫组抗体效价为1:45.7和1:33.9,高于E54-2全菌免疫组和纯化蛋白免疫组。 综上结果表明,构建的PRRSV GP4、GP5多表位真核重组表达质粒在小鼠体内可诱导特异性抗体产生,原核表达的GP4、GP5多表位串联肽具有良好的免疫原性,有开发成疫苗的潜在价值。