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本论文利用胆碱酯酶活性可被有机磷农药所抑制的毒理机制,采用酶抑制分光光法对农产品中有机磷农药残留进行快速检测。针对目前这种快速检测方法所使用的胆碱酯酶尚无标准的制剂且不同来源的酶制剂酶活性差别大,影响检测效果的问题,以不同来源的动物胆碱酯酶为试材,通过对胆碱酯酶的活性和耐藏性的比较及其它特性的综合分析,筛选出来源充足、酶活高、耐保藏的酶源;针对酶抑制分光光度法使用的胆碱酯酶的纯度直接决定检测效果,试验将筛选出的动物胆碱酯酶进行分离纯化,提纯出一种灵敏度及纯度高的胆碱酯酶;通过对不同处理的胆碱酯酶耐藏性的比较和保存方法的筛选研究,确定胆碱酯酶制剂的适宜制备方法;通过对胆碱酯酶包装材料的筛选研究,确定适宜的酶制剂的包装材料。具体胆碱酯酶的分离纯化步骤:粗酶液经硫酸铵饱和溶液盐析后透析,再经DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析。研究结果表明,不同动物来源的胆碱酯酶酶活力存在差异,马血清中的胆碱酯酶的酶活力明显高于其它动物来源的酶活力,综合考虑不同酶源的酶活、来源充足性、取材方便性、保藏性等因素,筛选出马血清作为适宜酶源。通过对纯化后的胆碱酯酶性质研究得出酶的适宜反应温度为35℃,适宜pH值为7.5,对底物氯化乙酰胆碱的K<,m>值为0.192mmol/L,适宜底物浓度为4mmol/L,高浓度底物对酶有抑制作用,该酶对热不稳定。敌敌畏、敌百虫和辛硫磷对胆碱酯酶的抑制中浓度分别为0.061mg/kg、0.260mg/kg、0.204mg/kg;真空冷冻干燥法制作酶粉制剂效果较佳,酶制剂采用硫酸纸包装,在-20~25℃条件下保存。
将本试验所制备的胆碱酯酶制剂应用到蔬菜中农药残留的检测,并对酶抑制分光光度法快速检测蔬菜中有机磷农药残留的检测条件进行了筛选研究,利用该方法进行了市场抽样检测,结果表明,提取纯化的马血清胆碱酯酶制剂可用于蔬菜中有机磷类农药残留的快速测定,检测限可达0.023mg/kg,可以满足国家规定的蔬菜中有机磷农药残留检测的要求;通过正交试验确定检测敌敌畏的适宜条件为:抑制时间15min,抑制温度35℃,底物用量0.1mL,酶液用量0.1mL;检测敌百虫的适宜条件为:抑制时间20min,抑制温度35℃,底物用量0.1mL,酶液用量0.1mL;检测辛硫磷的适宜条件为抑制时间20min,抑制温度35℃,底物用量0.1mL,酶液用量0.1mL,以敌百虫和辛硫磷为抑制剂其抑制效果不如敌敌畏的好,在检测敌百虫和辛硫磷农药残留时可将抑制时间适当的延长。在市场抽样调查几种蔬菜有机磷农药残留状况中,小白菜和黄瓜的污染状况较为严重,生菜、芸豆其次。