疫苗接种是减少病原微生物所导致的疾病和死亡的有效手段。直到20世纪末,减毒活疫苗和全细胞灭活疫苗一直是支撑人类预防传染病的主要武器。但是,接种这类疫苗通常伴随局部反应、发烧或关节疼痛等副作用,甚至会出现罕见的严重疾病和死亡病例。因此,更安全的亚单位疫苗成为了过去数十年来疫苗开发的热点,这类疫苗通过针对一种或几种选定的抗原来实现对机体的免疫保护。糖疫苗就是其中一种重要的亚单位疫苗。上个世纪70年代以来,人们研究发现纯化的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、B 型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b）和脑膜炎球菌（Neisseria meningitidis）的荚膜多糖（capsular polysaccharides,CPS）作为疫苗能够有效地预防成人感染。虽然Avery和Goebel在20世纪30年代初就已经提出将糖与载体蛋白（carrier protein,CP）缀合以提高糖抗原的免疫原性的理论,但直到20世纪80年代人们才开发出基于该理论的糖缀合物疫苗,应用于婴儿可使其获得抵抗相应病原体的能力。目前,糖缀合物疫苗,特别是抗细菌疫苗,已在许多国家进行常规接种。已批准应用于临床的糖缀合物疫苗的CP主要有破伤风类毒素（tetanus toxoid,TT）、白喉类毒素（diphtheria toxoid,DT）和交叉反应物质197的无毒突变体（cross-reacting material 197,CRM197）等。伴随糖缀合物疫苗在临床上的广泛应用,为数不多的这几个CP所引起的载体诱导表位抑制（carrier-inducedepitopic suppression,CIES）效应在不断增强,从而大大降低了糖疫苗的保护效果。因此,新型糖缀合物疫苗载体的开发和糖缀合物疫苗载体在免疫机制的深入研究对于克服现有问题、突破相关限制显得尤为重要。本论文将以A族链球菌（group A Streptococcus,GAS）胞外碳水化合物（group A carbohydrate,GAC）寡糖为抗原,评估以 GAS C5a 肽酶（GAS C5a peptidase,ScpA）的无毒突变体ScpA193作为新型蛋白质载体的GAC寡糖-蛋白缀合物的免疫保护作用。此外,本论文还研究了以肿瘤相关糖抗原（tumor-associated carbohydrateantigens,TACAs）唾液酸化 Tn（sialyl-Tn,sTn）的苯乙酰基衍生物sTnNPhAc为抗原、以MPLA为载体的新型糖脂缀合物疫苗的免疫保护作用及其诱导免疫反应的作用机制。论文主要包括以下三章内容:第一章 前言本章首先对糖疫苗的发展历史、开发应用现状和存在的不足进行了简要介绍。其次,结合本论文的研究内容,对以蛋白质为载体的GAS糖缀合物疫苗和以MPLA为载体的抗肿瘤糖疫苗的研究背景和开发现状进行了详细综述。最后,简要介绍了该论文的研究内容与意义。第二章半合成GAC寡糖-ScpA193缀合物疫苗的免疫活性评价一、GAC寡糖-ScpA193蛋白缀合物2a-c的免疫学研究:该部分主要对以ScpA193为载体的GAC三糖缀合物2a、六糖缀合物2b和九糖缀合物2c诱导的抗血清免疫学特征进行研究,同时与相应寡糖的CRM197和TT蛋白缀合物3a-c和4a-c进行了比较。在前期研究的基础上,本论文进一步研究了不同寡糖-蛋白缀合物所诱导的小鼠特异性抗体的亚型,发现所有寡糖-蛋白缀合物均能诱导产生多种亚型的特异性IgG抗体,其中2b和2c诱导的特异性抗体以生物学活性更好的IgG2b和IgG2c为主。通过GAC寡糖-蛋白缀合物所诱导的小鼠和兔抗血清的交叉反应实验、抗体结合实验以及抗血清介导的调理吞噬实验（opsonophagocytic killing assay,OPA）发现,三糖缀合物2a的抗血清与六糖和九糖交叉反应较差,而且其对GAS的识别和介导调理吞噬的能力均显著低于2b和2c的抗血清,这一结果同样存在于CRM197寡糖缀合物和TT寡糖缀合物中。与GAC三糖-蛋白缀合物和六糖-蛋白缀合物相比,GAC九糖-蛋白缀合物2c、3c和4c在抗体结合和介导调理吞噬的实验中均具有明显的优势。同种糖抗原的不同CP缀合物比较显示,以ScpA193为载体的寡糖缀合物的体外生物活性不弱于其它两种载体（CRM197和TT）的寡糖缀合物。此外,ScpA193蛋白诱导的抗血清没有表现出对GAS菌株J17A4的有效识别和介导调理吞噬的能力。由此可见,九糖抗原是这些寡糖中更有效的GAC表位,而GAC九糖-蛋白缀合物具有最高的体外生物活性。二、GAC寡糖-ScpA193缀合物2b和2c对小鼠感染GAS的保护作用:C57BL/6小鼠接种寡糖缀合物2b和2c或注射这两种寡糖-蛋白缀合物的兔抗血清后,使用GAS菌株J17A4进行感染。实验结果表明,两种免疫方式均可提高小鼠抗GAS感染的能力。其中在体内清除GAS的能力评价中,接受2b和2c或它们诱导的兔抗血清的小鼠,均显著降低了 GAS在小鼠肺部和腹腔的定殖。小鼠生存期实验证明,GAS腹腔冲击21 d内,2b和2c或它们诱导的兔抗血清能够有效降低GAS感染导致的小鼠死亡。此外,通过对肺部感染GAS的小鼠肺组织切片HE染色观察发现,糖缀合物组的小鼠肺部炎症较轻。在以上实验中缀合物2c均表现出更好的保护效果。因此,GAC六糖和九糖-ScpA193缀合物2b和2c,特别是后者,能够有效地保护小鼠,增强其抵御GAS感染的能力,因而具有开发成为GAS疫苗的潜力。三、GAC六糖和九糖-ScpA193缀合物2b和2c对小鼠的CD4+T细胞的激活作用:通过提取接种寡糖-蛋白缀合物2b和2c的小鼠的脾脏淋巴细胞,并用灭活的GAS（inactivated GAS,InGAS）进行体外刺激,检测CD4+T细胞的激活、增殖和细胞因子的分泌,评价了这两种寡糖缀合物所引起的免疫反应类型。流式细胞技术分析结果显示,InGAS体外刺激后的2b和2c组的CD4+T细胞亚群中,CD69+细胞占比显著高于HEPES组。羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE）着色实验表明,2b 和 2c 组发生了较多的抗原特异性T细胞增殖现象。对CD4+T细胞亚群中分泌细胞因子的细胞比例分析发现,与HEPES组相比,InGAS能上调2b和2c组中分泌IFN-γ和IL-4的细胞比例。因此,我们推测接种寡糖缀合物2b和2c能够诱导小鼠产生抗原特异性T细胞,并且使CD4+T细胞向Th1和Th2亚群分化,增强小鼠的细胞免疫和体液免疫功能。第三章以MPLA为载体的全合成自佐剂抗肿瘤缀合物疫苗sTnNPhAc-MPLA的免疫活性评价与作用机制研究一、sTnNPhAc-MPLA缀合物对免疫细胞的影响:我们选用小鼠腹腔巨噬细胞模型和酶联免疫斑点检测（enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）实验探究了单磷酰脂质 A（monophosphoryl lipid A,MPLA）为载体的 sTnNPhAc-MPLA糖脂缀合物作为全合成疫苗对B细胞和T细胞的影响。sTnNPhAc-MPLA或其载体MPLA孵育的巨噬细胞上清中IL-6和TNF-α的含量均升高,但是几乎没有检测到IL-1β。ELISPOT实验结果发现,接种sTnNPhAc-MPLA小鼠的脾脏淋巴细胞在使用相同的抗原刺激后,IFN-γ和IL-4的斑点没有增加。因此,我们推断糖抗原sTnNPhAc没有改变MPLA对巨噬细胞的刺激特点,且sTnNPhAc-MPLA引起的免疫反应不依赖T细胞的激活。进一步研究发现,sTnNPhAc-MPLA诱导BALB/c和BALB/c-nu小鼠产生的主要抗体亚型不同。这一结果表明,在IgG抗体亚型转变过程可能与其它抗原刺激T细胞分泌的细胞因子有关。二、MPLA的使用方式对免疫效果的影响:该部分研究设计了三种含有MPLA 的制剂:MPLA 与 sTnNPhAc 混合、MPLA 与 sTnNPhAc 嵌合和 MPLA 与sTnNPhAc缀合。通过ELISA检测抗sTnNPhAc特异性抗体的含量评价了三种不同制剂免疫正常小鼠（BALB/c）和胸腺缺陷小鼠（BALB/c-nu）后产生抗体的速度与强度。结果显示,相同制剂诱导不同品系的小鼠后产生抗体的速度和强度类似,再次证明以MPLA为载体的缀合物为非T细胞依赖（T cell independent,TI）型抗原。通过对比特异性抗体产生的情况得出三种不同制剂的免疫效果为:缀合＞嵌合＞混合,因此,以缀合物的形式激活免疫效果最强。三、sTnNPhAc-MPLA缀合物诱导的抗血清体外杀伤肿瘤细胞活性研究:唾液酸（Neu5Ac）生物合成途径中的合成酶具有一定的底物相容性。N-苯乙酰-D-甘露糖胺（N-phenylacetyl-D-mannosamine,ManNPhAc）能够与 Neu5Ac 的天然前体N-乙酰-D-甘露糖胺（N-acetyl-D-mannosamine,ManNAc）竞争参与相关生物合成途径,从而使细胞表面表达Neu5PhAc。sTn为唾液酸化的二糖,通过上述细胞代谢工程技术,我们可以使表达sTn的肿瘤细胞表达sTnNPhAc。本实验选用高表达sTn的野生型（wildtype,WT）MCF-7细胞,将其与ManNPhAc共孵育,通过细胞代谢工程技术使MCF-7细胞表达sTnNPhAc抗原,以此评价sTnNPhAc-MPLA诱导的抗血清对WT和修饰后的MCF-7细胞的抗体结合能力与体外杀伤效果。抗体结合实验结果显示,抗血清能够特异性识别两种MCF-7细胞,且对修饰后的MCF-7细胞的识别更强。因此,该缀合物诱导的特异性抗体可以很好地识别sTnNPhAc,而且对sTn也有一定的交叉反应。抗体介导补体依赖的细胞毒实验结果表明,sTnNPhAc-MPLA诱导的抗血清选择性裂解WT MCF-7和修饰后的MCF-7细胞。综上所述,本论文深入研究了基于新型载体的GAC寡糖-ScpA193缀合物以及sTnNPhAc-MPLA缀合物所诱导的免疫反应与相关机制,其意义在于:①首次发现GAC九糖-ScpA193缀合物2c能够诱导产生高滴度的IgG抗体,且发现由2c免疫小鼠和兔获得的抗血清均表现出很好的体外杀菌效果以及对小鼠感染GAS具有保护作用,作为候选GAS疫苗,具有开发价值;②首次在小鼠模型上比较了 MPLA的不同应用方式对免疫效果的影响,确定了以MPLA为载体的缀合物能够最大限度地诱导免疫反应;③首次直接证明了以MPLA为载体的寡糖缀合物sTnNPhAc-MPLA是TI抗原,其诱导的抗血清还具有在体外介导选择性杀伤肿瘤细胞的能力,为开发针对T细胞缺陷人群有效的疫苗带来希望。