论文部分内容阅读
目的：探讨前体蛋白加工酶PACE4在前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia,BPH).前列腺上皮内瘤变(Prostate intraepithelial neoplasia,PIN)及前列腺癌(Prostate cancer,PCa)组织中的表达及其与前列腺癌临床分期、血清PSA水平、Gleason评分之间的关系；在细胞水平验证PACE4的表达与细胞增殖能力和侵袭能力的关系,预测分析PACE4的干扰niRNA,验证miR-124对前列腺癌细胞系DU145中PACE4表达调节以及细胞增值、迁徙和侵袭特性的影响,为前列腺癌的诊断、监测以及随诊提供新的可供参考的标志物,为前列腺癌的治疗提供新的靶点。方法：应用免疫组化SP法检测PACE4在72例前列腺癌、10例前列腺上皮内瘤变和40例良性前列腺增生症组织中的表达,并与前列腺癌临床分期、血清PSA水平及Gleason评分之间的关系进行统计学分析；培养前列腺癌细胞系DU-145、PC.3.LNCaP.C42和前列腺增生细胞株BPH-1,细胞计数、软琼脂克隆实验和侵袭实验验证细胞株的增殖能力和侵袭能力,应用Realtime PCR.Westernblot检测各细胞株中PACE4及相关信号分子的表达状况,应用免疫荧光染色显示各细胞中PACE4的表达。预测分析PACE4的干扰miRNA,检测PACE4高表达、低表达和不表达的DU-145.C42和BPH-1中所预测niRNA的表达,根据上述实验结果,通过与信息库比对预测miR-124直接靶向PACE4-3’UTR,利用双荧光素酶报告系统实验确定目标miRNAs,构建pMIR-Report-PACE43’UTR报告质粒和pMIR-Report-mut-PACE43’UTR报告质粒,转染293T细胞和荧光素酶报告分析系统分析结果。设计、合成miR-124的oligo片段和inhibitor片段,脂质体LipofectamineTM RNAiMAX将其转染进入DU-145、C42和BPH-1细胞内,Realtime PCR和Westernbloting检测细胞内PACE4mRNA和蛋白水平的表达。利用流式细胞仪检测DU145细胞转染miR-124以后的细胞周期变化,分析细胞增殖能力；利用Martrix胶侵袭实验检测细胞侵袭能力变化。采用免疫细胞染色检测转染miR-124后,DU-145细胞表达MUC1的变化,并将实验结果进行分析。结果：(1)PACE4在PCa.PIN及BPH中的阳性率分别为92%、80%及20%,PCa和BPH两组中的阳性表达差异有统计学意义(P<0.05),而在PCa和PIN中的阳性表达无明显差异(P>0.05).PACE4在前列腺癌中的表达与患者临床分期.血清PSA水平、肿瘤分级(Gleason评分)密切相关(P<0.05).PACE4阳性率与肿瘤临床分期呈正相关(P<0.01),Ⅰ期和Ⅲ期、Ⅳ期之间差异有统计学意义(P<0.05);与Gleason评分呈正相关(P<0.01),随肿瘤Gleason评分的增高PACE4阳性率呈上升趋势。术前PSA水平<10ng/ml和>20ng/ml两组组间差异有统计学意义(P<0.05)。PACE4在有无骨转移两组间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)培养前列腺癌细胞株DU-145、PC3、LNCaP、C42及前列腺增生细胞株BPH-1,其中DU-145细胞的增殖能力和侵袭能力最强,C42在PCa细胞株中增殖能力和侵袭能力最弱。利用Realtime PCR和Western blot检测细胞中PACE4及相关信号分子的表达,发现PACE4在DU-145中表达最高,前列腺癌细胞株中C42较少,所有细胞株中BPH-1最少,同时其关信号分子基因水平IGFBP3和THBS1表达及Furin、Seprine2、MUC、CDK6高表达,蛋白水平P53、MUC1及PTEN高表达,细胞免疫荧光显示DU145细胞中PACE4的表达也最高,以上结果提示PACE4表达水平与前列腺癌恶性程度及侵犯转移密切相关。(3)利用生物学软件预测分析PACE4的干扰miRNAs,根据预测结果选取mir-9-5p、mir-506-3p、hsa-mir-124-3p、mir-590-5p和mir-21-5p,选用明确的PACE4高表达、低表达和不表达的DU-145、C42和BPH-1通过Realtime PCR检测以上miRNAs的表达,发现miR-124、miR-21在DU-145中的表达明显低于在BPH-1中的表达,miR-124、miR-21在DU-145和BPH-1中表达存在明显差异(P<0.05)；双荧光素酶检测niRNA与PACE43’UTR的关系,并转染293T细胞,荧光素酶报告分析系统分析结果,过表达miR-124和miR-21后,报告系统的荧光值显著减少(P<0.05),提示miR-124、miR-21与PACE43’UTR存在靶向关系；将miR-124转染进入DU-145、C42和BPH-1细胞内,Realtime PCR和、Vestern blot检测细胞内PACE4mRNA和蛋白水平的表达,并检测细胞转染miR-124以后的细胞周期变化,分析细胞增殖能力及侵袭能力的变化。发现将miR-124转染DU-145细胞后,转染组细胞增殖、迁移和侵袭能力减低,细胞周期阻滞,而转染了miR-124inhibitor片段C42细胞和BPH-1细胞的细胞增殖、迁移和侵袭能力升高,细胞表达MUC1水平也同时升高,而转染miR-124后DU145细胞表达MUC-1显著减少。提示miRNA可通过抑制PACE的表达使细胞的增殖和迁移能力下降,细胞的恶性都减少。结论：前列腺癌组织中PACE4高表达,并与前列腺癌的临床分期、血清PSA水平及Gleason评分有密切相关,提示PACE4可作为前列腺癌的一个有价值的诊断指标。预测分析PACE4的干扰miRNA, miR-124可直接靶向PACE4-3’UTR,将miR-124转染DU-145后细胞增殖、迁移和侵袭能力减低,细胞周期阻滞,提示miR-124可通过抑制PACE4的转录来抑制前列腺癌的增值和转移。