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【目的】
探讨EZY-1干预博来霉素(bleomycin,BLM)诱导小鼠肺纤维化的效果,评估EZY-1用药安全性,预测EZY-1参与信号通路及作用靶点,为开发EZY-1用于特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)治疗提供理论依据。
【方法】
采用本课题组建立的内窥镜下气管滴注BLM法诱导小鼠肺纤维化模型,经口给予EZY-1进行干预肺纤维化进程实验。取小鼠肺组织切片,通过HE染色、Masson染色评估肺组织病理变化。进行小鼠急性毒性实验,评估EZY-1在体内的急性毒性;体外利用克隆形成实验、MTT实验检测EZY-1对人肺上皮组织来源的A549细胞和95D细胞增殖的影响。采用Pull-down实验结合液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)明确能与EZY-1体外直接结合的蛋白质,并通过生物信息学方法预测可能的信号通路及靶点。通过Transwell小室实验探究EZY-1对细胞迁移、侵袭能力的影响。基于转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)诱导A549细胞肺纤维化模型,用Westernblot检测EZY-1干预后细胞内Smad3、p-Smad3(Ser423/Ser425)、Smad4、β-catenin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达变化;用ELISA检测细胞培养基中Collagen-Ⅰ含量。
【结果】
1.动物实验结果显示,BLM造模28天后,模型组小鼠肺组织存在明显的炎症反应及胶原纤维沉积;EZY-1和吡非尼酮(pirfenidone,PFD)的干预均可有效抑制BLM诱导的小鼠肺组织病理改变;EZY-1(1 mg/kg)使用剂量小于PFD(50 mg/kg)。
2.24h内分两次灌胃给予小鼠总剂量达到5000mg/kg的EZY-1。在14天观察期内,EZY-1处理组和对照组小鼠生长状态良好、摄食量正常、体重变化无明显差异(P>0.05)。对小鼠进行大体解剖,均未见明显异常。
3.以小鼠肺脏为蛋白质来源进行Pull-down实验。LC-MS/MS分析获得EZY-1结合蛋白质950个,共参与960种GO生物过程、189种GO细胞组分和101种GO分子功能,涉及114条KEGG信号通路和306条Reactome信号通路。
4.以人A549细胞为蛋白质来源进行Pull-down实验,LC-MS/MS分析分别获得EZY-1结合蛋白662个和766个。从GeneCards检索到IPF相关靶点2792个。EZY-1结合蛋白质中有113个是IPF的疾病靶点。这113个蛋白质共参与763种GO生物过程和14种CORUM蛋白功能,涉及69条KEGG信号通路、287条Reactome信号通路和24条经典通路。
5.Westernblot结果显示ERK1/2、AKT、Rictor、SHP-2、Slug、p38MAPK、β-catenin、PDGFR-β、Vitronectin、AKT1和AKT2等蛋白质能够与EZY-1结合。
6.克隆形成实验、MTT实验的结果显示,EZY-1作用A549细胞和95D细胞72h,其在0~20μg/mL剂量对细胞存活、增殖无明显影响(P>0.05)。
7.Transwell小室迁移结果显示20μg/mLEZY-1抑制A549细胞迁移(P<0.05),Transwell小室侵袭结果显示5~20μg/mLEZY-1抑制95D细胞侵袭(P<0.05)。
8.Westernblot结果显示,EZY-1下调了TGF-β1诱导的p-Smad3(Ser423/Ser425)、Smad4、β-catenin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达。
9.ELISA结果显示,EZY-1抑制了TGF-β1诱导的Collagen-Ⅰ分泌(P<0.05)。
【结论】
EZY-1在体内可抑制BLM诱导的小鼠肺纤维化,预测其作用途径包括TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR、JAK2/STAT3,潜在靶点包括β-catenin、SHP-2、Rictor、AKT、ERK1/2、PDGFR-β和Vitronectin。EZY-1在体外能抑制TGF-β1致肺纤维化模型,其机制与抑制TGF-β/Smad通路、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)进程及胶原分泌有关。另外,EZY-1在体内、体外模型中均显示无明显毒性。以上结论将为开发EZY-1成为IPF潜力药物提供理论依据。
探讨EZY-1干预博来霉素(bleomycin,BLM)诱导小鼠肺纤维化的效果,评估EZY-1用药安全性,预测EZY-1参与信号通路及作用靶点,为开发EZY-1用于特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)治疗提供理论依据。
【方法】
采用本课题组建立的内窥镜下气管滴注BLM法诱导小鼠肺纤维化模型,经口给予EZY-1进行干预肺纤维化进程实验。取小鼠肺组织切片,通过HE染色、Masson染色评估肺组织病理变化。进行小鼠急性毒性实验,评估EZY-1在体内的急性毒性;体外利用克隆形成实验、MTT实验检测EZY-1对人肺上皮组织来源的A549细胞和95D细胞增殖的影响。采用Pull-down实验结合液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)明确能与EZY-1体外直接结合的蛋白质,并通过生物信息学方法预测可能的信号通路及靶点。通过Transwell小室实验探究EZY-1对细胞迁移、侵袭能力的影响。基于转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)诱导A549细胞肺纤维化模型,用Westernblot检测EZY-1干预后细胞内Smad3、p-Smad3(Ser423/Ser425)、Smad4、β-catenin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达变化;用ELISA检测细胞培养基中Collagen-Ⅰ含量。
【结果】
1.动物实验结果显示,BLM造模28天后,模型组小鼠肺组织存在明显的炎症反应及胶原纤维沉积;EZY-1和吡非尼酮(pirfenidone,PFD)的干预均可有效抑制BLM诱导的小鼠肺组织病理改变;EZY-1(1 mg/kg)使用剂量小于PFD(50 mg/kg)。
2.24h内分两次灌胃给予小鼠总剂量达到5000mg/kg的EZY-1。在14天观察期内,EZY-1处理组和对照组小鼠生长状态良好、摄食量正常、体重变化无明显差异(P>0.05)。对小鼠进行大体解剖,均未见明显异常。
3.以小鼠肺脏为蛋白质来源进行Pull-down实验。LC-MS/MS分析获得EZY-1结合蛋白质950个,共参与960种GO生物过程、189种GO细胞组分和101种GO分子功能,涉及114条KEGG信号通路和306条Reactome信号通路。
4.以人A549细胞为蛋白质来源进行Pull-down实验,LC-MS/MS分析分别获得EZY-1结合蛋白662个和766个。从GeneCards检索到IPF相关靶点2792个。EZY-1结合蛋白质中有113个是IPF的疾病靶点。这113个蛋白质共参与763种GO生物过程和14种CORUM蛋白功能,涉及69条KEGG信号通路、287条Reactome信号通路和24条经典通路。
5.Westernblot结果显示ERK1/2、AKT、Rictor、SHP-2、Slug、p38MAPK、β-catenin、PDGFR-β、Vitronectin、AKT1和AKT2等蛋白质能够与EZY-1结合。
6.克隆形成实验、MTT实验的结果显示,EZY-1作用A549细胞和95D细胞72h,其在0~20μg/mL剂量对细胞存活、增殖无明显影响(P>0.05)。
7.Transwell小室迁移结果显示20μg/mLEZY-1抑制A549细胞迁移(P<0.05),Transwell小室侵袭结果显示5~20μg/mLEZY-1抑制95D细胞侵袭(P<0.05)。
8.Westernblot结果显示,EZY-1下调了TGF-β1诱导的p-Smad3(Ser423/Ser425)、Smad4、β-catenin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达。
9.ELISA结果显示,EZY-1抑制了TGF-β1诱导的Collagen-Ⅰ分泌(P<0.05)。
【结论】
EZY-1在体内可抑制BLM诱导的小鼠肺纤维化,预测其作用途径包括TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR、JAK2/STAT3,潜在靶点包括β-catenin、SHP-2、Rictor、AKT、ERK1/2、PDGFR-β和Vitronectin。EZY-1在体外能抑制TGF-β1致肺纤维化模型,其机制与抑制TGF-β/Smad通路、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)进程及胶原分泌有关。另外,EZY-1在体内、体外模型中均显示无明显毒性。以上结论将为开发EZY-1成为IPF潜力药物提供理论依据。