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本研究首先对分离鉴定的牛源结核分枝杆菌进行药物敏感性分析;确定对一线抗结核药物具有耐药性的菌株作为实验菌株;重点探讨耐药菌株产生耐药性的分子机制。在此基础上筛选多个中药单体作用于分离菌株考察其敏感性,并将中药单体与抗结核药物INH、RFP、SM联合作用于牛源结核分枝杆菌,评价中西药联合作用效果,为中西药联合应用抗结核分枝杆菌研究奠定基础。
应用Z-N氏染色法及PCR方法对菌株进行鉴定,确定分离得到的临床菌株为结核分枝杆菌复合群菌株;采用噬菌体生物扩增法(Phage amplified biologically assay,PhaB)检测菌株对药物的敏感性。进一步应用PCR-直接测序法检测耐药结核分枝杆菌相关蛋白的编码基因,分析katG、rpoB、rpsL基因突变与耐药性产生的关系;利用微孔阿尔玛兰分析法(Microplate Alamar Blue Assay,MABA)将中药单体分别与INH、RFP、SM联合作用于牛源结核分枝杆菌后,测定其联合作用的FICIs值,以此评价联合作用效果。分离鉴定得到MTC 44株,阳性率为23.28%(44/189)。PhaB法对44株临床分离菌株进行耐药表型检测,其中14株对INH耐药,6株对RFP耐药,9株对SM耐药,2株为INH、RFP多重耐药菌株。PCR-DS结果显示31株耐药株中11株katG基因发生突变, 5株rpoB基因突变,7株rpsL基因突变;2株多重耐药菌株均在rpoB基因531位点和katG基因315位点发生基因突变。筛选了18β-GA、PGA、黄连素Berberine、鱼腥草素钠Sodium houttuyfonate、苦参素Oxymatrine、苦参总碱Banlangen共6种中药作用于结核分枝杆菌,选择出具有良好抗菌活性的中药单体18β-GA和PGA与抗结核药物联合,进行药敏实验,发现中药单体18β-GA联合INH、RFP、SM作用于牛源结核分枝杆菌后MIC值分别显著下降4-16倍、4-8倍、4-8倍;PGA联合INH、RFP、SM后MIC值均下降4-16倍。
研究结果表明基因突变仍然是导致结核分枝杆菌产生耐药性的主要因素,牛源结核分枝杆菌中katG基因突变以315位点为主,rpoB基因突变以531位点为主,rpsL基因突变以43位点为主。筛选了6种对结核分枝杆菌有抗菌效果的中药单体化合物,其中18β-GA和PGA与抗结核药物联合应用后,表现出较好的协同作用效果。