论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌是种严重危害人类健康的食源性病原菌，在环境中广泛分布。目前对于金黄色葡萄球菌所引发的食品中毒事件频发，因此针对该菌快速、简便、灵敏的检测方法是监控该菌关键。本研究制备了SPA及其单克隆抗体，对其生物学活性进行了分析鉴定，建立了检测金黄色葡萄球菌的双抗体夹心ELISA方法，为该菌的防控监测提供有用的检测手段。应用热PBS浸出法提取SPA,通过离心，酸沉淀，乙醇沉淀粗提，将粗提的蛋白再经过KTA prime蛋白纯化系统SephadexS-200凝胶层析纯化，以丙种球蛋白作为抗检测SPA；SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度及分子量。使用KTA prime蛋白纯化系统SephadexS-200凝胶层析出现4个洗脱峰，2号收集管洗脱液和3号收集管洗脱液经间接ELISA试验检测OD450值最高；合并后蛋白浓度测定仪测得蛋白含量为0.506mg/mL；SDS-PAGE电泳显示在约12KD处有条明显的电泳条带。制备的SPA纯度达到免疫纯，活性高，特异性强，是制备抗SPA单克隆抗体的理想材料。为了获得稳定性好、特异性强、效价较高的抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体。用热灭活的金黄色葡萄球菌wol-04菌体抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）融合，以SPA为筛选抗原进行克隆筛选，并对各株单抗的生物学特性进行分析和鉴定。获得6株稳定分泌SPA单克隆抗体的杂交瘤细胞，6株单抗与其他菌株没有交叉反应，其中单克隆抗体3B11、4F7为SPA表面抗原表位的单克隆抗体，与金黄色葡萄球菌wol-04菌体和SPA有较强的免疫反应性，免疫球蛋白亚类分别为IgG1和IgG3，具有稳定性好、特异性强、效价较高等特点。取单克隆抗体3B11，采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶（HRP）酶标抗体得到3B11-HRP检测抗体。以单克隆抗体4F7为捕获抗体、3B11-HRP为检测抗体建立双抗体夹心ELISA方法。该方法对金黄色葡萄球菌具有特异性，与受试的非金黄色葡萄球菌菌株没有交叉反应，对金黄色葡萄球菌纯培养菌液检出限为110~5CFU/mL。本研究建立的双抗体夹心ELISA检测方法对金黄色葡萄球菌具有较高的特异性和灵敏度，该方法有望与其他方法相结合用于对金黄色葡萄球菌的检测。