生物多样性是人类赖以生存和环境可持续发展的基石，认识和保护生物多样性是全世界生物学家面临的重要课题，也是所有世界公民均需承担的重要责任。原生生物和其他微生物由于个体微小常在生物多样性研究中被忽略。在微食物网的物质和能量流动中扮演重要角色的纤毛虫(Ciliophora, Alveolata)历数10亿多年的进化演替形成今天结构高度特化、多样性极高的一类原生动物。很多研究证明纤毛虫的生物多样性研究可以为演化生物学、细胞生物学、分子生物学及生态学等学科提供重要的数据支持和素材模型。但由于传统分类学的局限性，纤毛虫原生动物的生物多样性研究一直比较落后且面临很多困难。在此背景下，作者博士期间主要开展了纤毛虫生物多样性研究中DNA条形码分子标记的筛选和评估工作，明确了纤毛虫原生动物适用的DNA条形码基因，在此基础上可以开展更多的纤毛虫生物多样调研工作，以期更好的挖掘和利用该类生物在以上研究领域的潜在功能和研究价值。1.寡膜纲和旋唇纲内四个主要代表阶元的条形码基因的评估和筛选(1)基于Cox I基因的DNA条形码技术在草履虫物种鉴定中的可行性探讨：本工作我们选取纤毛虫Oligohymenophorea纲的代表属草履虫(Paramecium)作为研究对象，利用多个近缘种和种群的Cox I基因(包括本工作提交至GenBank数据库的148条Cox I基因新序列)进行了单倍型网络分析，生物地理学分析，异质性检验分析等，提出Cox I基因个体异质在同种群的草履虫纤毛虫中普遍存在及不同种不同水平的细胞内异质性现象，另外也提出了线粒体假基因在纤毛虫中存在的可能；通过系统树构建及变异贡献来源分析等，证实了Cox I基因可作为草履虫近缘物种区分的DNA条形码基因，同时发现该基因丰富的遗传变异有助于我们发现那些隐存种和认识更多的纤毛虫物种多样性。(2)利用核基因作为旋唇纲丁丁类分子标记的功效初探：本工作通过对比一些近缘丁丁类纤毛虫(包括4个科5个属)的ITS2二级结构及基于ITS-5.8S (包括本工作提交GenBank数据库的11条新序列)和SSU rDNA的系统树构建分析，阐述了丁丁类传统分类学中依据透明质壳和凝集质壳特征等特征定种的非确定性，并发现这些特性在系统发生关系上可多个属多源发生因此并没有太多的种类鉴定价值。相比而言，分子信息在一定程度上纠正上述错误并帮助一些近缘丁丁类纤毛虫的系统地位的识别和确定。此外，我们还发现ITS2二级结构信息可在一定程度上较清晰的反映丁丁类近缘种的遗传差异。(3)评估线粒体及核基因作为前口虫条形码候选基因的功效：本工作中我们选取纤毛虫寡膜纲中与草履虫近缘的一批形态信息较完善的前口虫(Frontonia)作为研究对象，通过对16个种34个不同样本的三个核基因及线粒体Cox I基因的序列扩增(本工作共提交多基因新序列至GenBank192条)，核基因不同变异区及Cox I遗传距离的分析、系统发生树构建及基于形态学特征的对比分析，评估了核基因和线粒体基因分别作为前口虫DNA条形码基因的功效，结果发现SSUrDNA的V2、V4区，LSU rDNA的D1区及5.8S基因变异速率较慢没有明显的DNA条形码gap区，不能很好的进行近缘种的种类界定；ITS1区具有较高的无规律变异，不适于进行种类界定；具有适中变异速率的核基因ITS2、LSU-D2区及Cox I基因可作为前口虫DNA条形码基因，相比而言Cox I基因具有更好的区分力度。但由于目前纤毛虫的线粒体遗传来源的研究比较复杂还不清晰，因此我们建议纤毛虫的DNA条形码基因增加核基因的辅助研究。另外基于多特征条形码信息和多基因分析我们还发现前口虫为非单源发生，可稳定分为三个不同的组(Group I，II，III)。(4)游仆虫的种群结构及条形码基因的筛选：本工作我们选取了旋唇纲游仆虫(Euplotes)复合属的60个样本22个种进行了传统DNA条形码基因Cox I及核基因SSU rDNA，ITS-5.8S及LSU rDNA的序列扩增(共计178条新序列)和分析，结果Cox I基因扩增效率极低(仅一个种扩增出部分序列)。通过对游仆类与其他纤毛虫线粒体Cox I基因的序列分析及编码蛋白二级结构预测分析，揭示了该基因在该属具有很高的遗传分歧因此较难设计通用引物，该基因可能不适宜作为游仆虫的DNA条形码基因；相比而言，上述核基因的扩增效率高达99%。通过对上述基因不同变异区种内及种间遗传距离的统计分析，结果显示ITS2及LSU-D2区间的种间遗传差异要高于种内遗传差异可形成较明显的BarcodingGap，因此本工作认为上述区间更适合作为游仆虫的DNA条形码候选基因。但多种群种下遗传距离分析显示核基因种内遗传分歧整体偏小，不适宜作为种群结构探讨的标记基因。另外基于多个核基因的系统发生学分析结果显示，游仆虫复合属遗传结构较为多样，遗传信息与传统基于背面银线系、细胞发生学、皮层结构及生境信息划分的三个组或四个属不保持一致，这也在一定程度上也反映了演化事件本身的复杂性。2.纤毛虫和相关类群的线粒体比较基因组分析(1)古虫界阿米巴类细胞黏菌Acrasis kona的线粒体基因组分析：本工作通过454FLX+和Illumina GAIIx平台获取基因组测序数据，并利用MIRA软件数据包从下一代测序(Next generation sequencing, NGS)大数据中用MITObim的技术路线baiting出线粒体基因组的数据并完成拼接。数据分析结果显示Acrasiskona线粒体基因组大小约为51.5kb富含AT (83.3%)，和近缘种Naegleria相比存在40%的编码蛋白基因丢失，但它们有50%的tRNAs相同。Acrasis kona线粒体基因组中还存在类似植物线粒体基因组的DYW型PPR和Thg1蛋白，上述蛋白与RNA编辑有关。另外还发现一些Numts的存在，说明Acrasis kona可能发生了线粒体基因向核基因水平基因转移的近期事件。Acrasis kona线粒体基因组的分析进一步证明原生动物线粒体演化路径的不同及其遗传机制的多样性。(2)纤毛虫线粒体基因组的分析及多种特定真核生物线粒体Cox I基因的比较：纤毛虫已测线粒体基因组有10个，它们分别属于Oligohymenophorea、Spirotrichea及Nassophrea纲，通过对这些纤毛虫线粒体基因组的基因结构、排布及遗传特征分析，证明了纤毛虫线粒体基因有超乎寻常的遗传多样性。通过搜索NCBI数据库中已测序真核生物线粒体基因组信息，获取包括纤毛虫在内的约80余种COI氨基酸序列，通过序列比较和系统发生学分析揭示了纤毛虫的Cox I基因在演化路径上非常特殊，其超乎寻常并高度变异的插入区在近缘种间都具有很大的遗传分歧，这与Cox I基因在大多数真核生物中较为保守的特征不同。另外系统发生学分析显示，纤毛虫从其他所有真核生物中分离出来单独聚为一支，也进一步说明该基因在纤毛虫中有着不同于其他真核生物的遗传机制和演化路径。上述结果证明传统DNA条形码技术在纤毛虫的生物多样性研究中存在一定的局限性，因此我们建议纤毛虫生物多样性的研究工作应从具有适度变异、存在更多遗传拷贝和遗传信息，且易于设计通用引物的核基因中筛选合适的DNA条形码基因。