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研究活细胞内的蛋白质-蛋白质相互作用对于了解生命的活动过程具有重要意义。双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)技术是近些年来发展起来的广泛应用于研究体内蛋白质互作及其定位的新技术。与酵母双杂交、蛋白质片段互补、生物发光共振能量转移、荧光共振能量转移等用于研究体内蛋白质相互作用的技术相比,BiFC技术具有灵敏度高、噪声低和易于操作等优势。但是,荧光蛋白生色团的缓慢成熟限制了 BiFC技术应用于细胞瞬时或动态相互作用的可视化研究。同时,目前已用于BiFC技术的荧光蛋白中也只有少数(Cerulean、Citrine、Venus等)可以在生理温度(37 ℃)下发生荧光互补,所以亟需发展新的BiFC系统。本研究基于Branchiostoma lanceoatumm来源的mNeonGreen蛋白发展了 一个迄今为止亮度最强且成熟时间最短的BiFC系统。mNeonGreen蛋白是由四聚体LanYFP蛋白改造而来的单体黄绿色荧光蛋白,其亮度比常用的绿色和黄色荧光蛋白亮1.5至3倍,且该荧光蛋白在37 ℃下的氧依赖性成熟时间是目前所报导的荧光蛋白中最短的(小于10分钟)。本研究首先根据mNeonGreen的基因序列通过密码子优化得到了人源化的mNeonGreen基因,再根据mNeonGreen的晶体结构将其分别从三个位点切开(Ala134-Asp135、158Asp-159Lys、Asn 173-Gly 174),通过同向平行亮氨酸拉链(bFos和bJun)在HEK 293T细胞中筛选到Asn173-Gly174是最佳拆分位点,所形成的两个片段能够产生很强的荧光信号(另外两种拆分方式无荧光信号),从而建立了基于mNeonGreen的BiFC系统。该系统缩短了 BiFC系统的响应时间,提高了 BiFC系统的灵敏度,有利于将BiFC技术应用于活细胞瞬时或动态相互作用可视化的研究。本研究的第二部分工作针对活体成像的“近红外(NIR)光学窗口(650-900 nm)”问题,深入研究并优化了波长较长(600/651 nm)且在37 ℃下成熟时间较短(T1/2≈28 min)的红色 BiFC 系统。本研究参照 mNeptune(600/651 nm)BiFC系统,对mNeptune二代(599/651 nm)荧光蛋白在同样的位点(155-156)进行了拆分,发现该系统荧光强度远弱于mNeptune 一代BiFC系统。于是对拆分后融合着相互作用蛋白的不同N肽段(bJun-N1、bJun-N2)和C肽段(bFos-C1、bFos-C2)进行了重新组合(bJun-N1+ bFos-C1、bJun-N1+ bFos-C2、bJun-N2+bFos-C1、bJun-N2+bFos-C2)。结果发现:重组后的 bJun-N1+bFos-C2BiFC 系统亮度最强,是原有mNeptune 一代BiFC系统(bJun-N1+ bFos-C1)亮度的两倍。为了探究荧光亮度提高的机理,体外纯化了 bJun-N1+bFos-C1和bJun-N1+bFos-C2蛋白,利用圆二色光谱测定其二级结构,结果表明这两种BiFC系统重构后的蛋白在二级结构上并无显著差异,因此该新的BiFC系统荧光强度提高的机理还有待于进一步的研究。此外,本研究还利用以上两种新建立的BiFC系统,针对被拆分后的荧光蛋白与相互作用蛋白(亮氨酸拉链)的融合方式进行了研究。结果表明,当以同向平行亮氨酸拉链bFos和bJun作为相互作用蛋白时,bJun-N+bFos-C的融合方式优于N-bJun+bFos-C及bJun-N+C-bFos的融合方式。该发现为bFos和bJun这对相互作用蛋白在BiFC系统中的应用提供了指导。