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脆性X综合征(fragileXsyndrome，FXS)是一种常见的遗传性智力低下性疾病，临床表现主要有不同程度的智力障碍、青春期后巨大睾丸、部分患者有特征性面容，如长脸、招风耳、高腭弓，以及自闭症等精神行为异常。FXS是由脆性X智障基因(fragileXmentalretardation1，FMR1)中5端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其异常甲基化，使FMR1基因失活，导致其编码的产物—脆性X智力低下相关蛋白(fragileXmentalretardationprotein，FMRP)表达的缺失或减少引起。形态学研究发现脆性X综合征患者和FMR1基因敲除小鼠树突棘成熟和修剪障碍，树突棘呈明显瘦长、扭曲的幼稚形态，不成熟的树突棘形成突触的能力严重受损。对FMR1基因敲除小鼠的电生理研究发现海马区代谢性谷氨酸受体(metabotropicglutamatereceptor，mGluR)所触发的长时程抑制(Long-termDepression，LTD)延长，长时程增强(Long-termPotentiation，LTP)不变。上述研究从结构和功能两方面都表明FMRP缺乏可导致突触可塑性改变，故目前认为其可塑性的改变是产生脆性X综合征智能低下的主要机理，但是FMRP如何影响突触可塑性至今仍不清楚。目前已知FMRP是一种mRNA结合蛋白，FMRP在细胞核与细胞质之间穿梭，改变与其结合的mRNA的亚细胞定位，影响转录过程及翻译后修饰，调节蛋白的表达，推测FMRP可能通过调节与神经系统结构和功能有关的蛋白来影响突触的可塑性，有研究表明在行为依赖的突触活动中FMRP的含量增高，也提示FMRP在突触可塑性中起重要作用。由于树突棘的改变是脆性X综合症的主要病理变化，且树突棘是构成哺乳动物中枢神经系统兴奋性突触传递的主要部位，因而寻找受FMRP调节的mRNA，并探讨其编码蛋白在树突棘发育及突触可塑性中的作用，对明确FXS的发病机制可能有重大意义。
近年新发现的棘相关的Rap三磷酸鸟苷酶激活蛋白(Spine-associatedRapGAP，SPAR)被发现与树突棘形态有关。已知树突棘主要构成兴奋性突触后膜，而SPAR也定位于突触后膜。树突棘的主要成分actin在维持棘的形态中起主要作用，研究表明SPAR具有与actin相联系的结构域(act1，act2)，SPAR还可以通过结构域GKBD与PSD-95相联系，而PSD-95被发现与树突棘密切相关。因此，我们有充足的理由推测SPAR与树突棘密切相关。本研究拟通过观察不同发育时期SPAR及SPARmRNA在小鼠脑组织中的表达分布，探讨SPAR在脑发育中可能的作用；并通过比较KO与WT小鼠脑组织中SPAR及SPARmRNA表达的不同，探讨SPAR表达是否受FMRP的影响，为研究脆性X综合症的发病机理提供一定的依据。
[材料和方法]1.实验动物：本研究采用的实验动物为FMR1基因敲除型(KO)纯合子(-/-)及其野生型(WT)纯合子(+/+)FVB近交系小鼠。
2.实验动物基因型鉴定：用PCR法检测实验小鼠的FMR1基因片断，用免疫印迹法检测FMRP的表达。
3.检测SPAR在小鼠脑区的表达与分布：第一部分，用免疫组化和蛋白印记法观察SPAR在小鼠脑区中的分布及表达。将小鼠分为成年(6周)KO组(KO6W组)、成年WT组(WT6W组)、幼年(1周)KO组(KO1W组)和幼年WT组(WT1W组)4组，每组10只。分别取每组实验动物脑组织做冰冻切片，用生物素标记、DAB显色免疫组化法并在显微镜下观察SPAR的分布及在海马和皮层中的表达情况。分别提取每组实验动物海马、皮层的全细胞蛋白，进行蛋白定量，将蛋白进行电泳分离、转膜，与SPAR抗体反应后，应用化学发光剂对蛋白进行检测。第二部分，海马神经元培养后用蛋白印迹法检测SPAR的表达。将新生小鼠分为KO组和WT组分布进行海马神经元的原代培养，共培养10批。培养到第7天后每组神经元各取部分抽提蛋白，用蛋白印迹法检测SPAR的表达。
4.检测SPARmRNA在小鼠脑区中的分布和表达：取小鼠分为成年(6周)KO组(KO6W组)、成年WT组(WT6W组)、幼年(10天)KO组(KO10d组)和幼年WT组(WT10d组)4组，每组10只。分别取脑组织做冰冻切片，用地高辛标记、DAB显色原位杂交法检测SPARmRNA的分布和表达。
5.图像采集：免疫组化，原位杂交的结果用图象分析仪分别对大脑皮质、海马的DAB显色的平均光密度值(meanopticaldensity，MOD)进行采集，蛋白印迹的结果用灰度分析软件扫描所得蛋白质条带，得出SPAR表达图像峰面积值，与β-actin表达峰面积值进行标准化处理。
6.统计：对两个年龄组之间及两个基因型之间海马和皮层的平均光密度值及蛋白印迹所得的标准化数值用配对t检验比较。用SPSS12.0软件进行统计学分析，P值小于0.05为差异有显著性。
[结果]1.FVB小鼠脑区中SPAR的分布：SPAR在KO及WT小鼠各个脑区普遍表达，尤其在海马、皮层表达丰富。大脑皮质中以纹状皮质、运动皮质、梨状皮质为主；海马各区均有高密度信号，以齿状核为主；大脑的核团中，在第三脑室周乳头体前核、丘脑、尾状核、缰核、内囊、杏仁核等处浓染；胼胝体上仅有少量分布。
2.SPAR的表达：将不同基因型小鼠免疫组化、蛋白印迹法检测的结果进行比较，发现KO6W组及KO1W中皮质、海马部位SPAR的表达均显著低于野生型，在培养的海马神经元中KO组SPAR表达显著低于WT组。不同年龄组比较，KO1W组及WT1W组中皮质、海马部位SPAR的表达显著高于KO6W组及WT6W组。P值均小于0.05。
3.SPARmRNA的表达：不同基因型比较，KO6W组及KO10d中皮质、海马部位SPARmRNA的表达均显著低于野生型。不同年龄组比较，KO10d组及WT10d组中皮质、海马部位SPARmRNA的表达显著高于KO6W组及WT6W组。P值均小于0.05。
[结论]SPAR及SPARmRNA在FVB小鼠各个脑区中普遍表达，在海马、皮层等神经元聚集处表达尤为丰富。在幼年小鼠中表达高而成年小鼠中降低，表明SPAR的表达与年龄相关。FMR1基因敲除小鼠海马和皮层中SPAR及SPARmRNA的表达均显著减少，提示SPAR的表达受FMRP的正性调节，考虑表达异常的SPAR可能与脆性X综合征树突棘发育障碍相关。SPAR在幼年小鼠中表达高而成年小鼠中降低，结合树突棘的的发育过程，提示SPAR与树突棘的发育相关。