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背景：
真菌性角膜炎是一种由致病真菌引起的致盲率极高的感染性角膜病变，其病变程度不仅与感染真菌的类别、真菌的毒力有关，也与宿主的抗真菌免疫反应有关。真菌性角膜炎角膜内中性粒细胞的募集是抵抗真菌最重要的防线[1]。中性粒细胞是真菌性角膜炎的关键免疫细胞。在感染早期大量中性粒细胞浸润角膜来杀灭真菌，同时过度的中性粒细胞浸润也会造成许多组织的损伤[2]。昼夜节律描述了一个以24h循环的方式振荡的生理现象。这些节律提供了适当的内稳态所需的临时框架。通过预测环境和内部的变化，细胞(和生物)可以有效地编程他们的生理任务。在细胞水平，昼夜节律起源于遗传因素(时钟基因)在自动调节转录翻译中反馈回路[3]。一项研究发现，延长光照时间明显延缓小鼠角膜上皮创伤后的再上皮化过程，并引起更多的炎症细胞的募集[4]。也有研究发现，斑马鱼幼体对细菌感染的先天免疫细胞应答是受光照调控的，光照时间延长促进了先天免疫细胞的募集[5]。真菌性角膜炎的病变程度与免疫反应息息相关，在不同光照条件下小鼠角膜的免疫反应尚未可知。在本研究中我们将探究在不同光照条件下，小鼠角膜真菌感染后的炎症反应情况。
目的：
研究真菌性角膜炎小鼠在不同光照条件下的角膜炎症反应情况。
材料和方法：
将207只小鼠随机分为三组，LD组(Light/Dark12h光照)69只，LL组(Light//Light24h光照)69只，DD组(Dark/Dark24h黑暗)69只，在不同光照条件下饲养14天，制作真菌性角膜炎模型(FK)171只小鼠及创伤模型(Truama)36只小鼠，使用9只FK模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组各3只)分别于造模前0h，及造模后12h、18h、24h、36h、48h、72h、120h、168h,和9只Truama模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组各3只)于造模后12h、18h、24h，均使用裂隙灯显微镜进行眼前段照相以及临床评分。使用81只FK模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组每个时间点各3只)分别于造模前0h，及造模后12h、18h、24h、36h、48h、72h、120h、168h,和27只Truama模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组每个时间点各3只)于造模后12h、18h、24h，处死小鼠后获取眼球，行免疫荧光染色角膜整铺片，以计算出在不同实验条件处理下和不同时间点的小鼠角膜中中性粒细胞和巨噬细胞的浸润量。使用27只FK模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组每个时间点各3只)分别于建立真菌性角膜炎模型后24h、36h、168h处死小鼠后剜取完整眼球进行HE染色。使用27只FK模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组每个时间点各3只)分别于建立真菌性角膜炎模型后24h、72h、168h处死小鼠后获取新鲜角膜组织，后用PDA培养基来培养角膜组织，进行角膜组织内载菌量的统计。使用27只FK模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组每个时间点各3只)分别于建立真菌性角膜炎模型后24h、36h、120h进行冰上取材获取角膜，提取角膜组织蛋白后使用LuminexFLEXMAP3D系统检测细胞因子IL-1β的浓度变化。
结果
1．同一时间点LDFK组和DDFK组的临床评分比较，接种真菌后24h角膜病变的临床评分相比，差异具有显著的统计学意义(P=0.000)；同一时间点LLFK组和DDFK组的临床评分相比，接种真菌后18h，24h和168h角膜病变的临床评分相比，差异具有显著的统计学意义(P=0.000，P=0.000，P=0.022＜0.05)。
2．LDFK组、LLFK组、DDFK组角膜内中性粒细胞均在真菌感染早期大量浸润，于36h到达峰值，而后逐渐开始下降。对相同时间点LDFK组与DDFK组、LDTrauma组及DDTrauma组角膜内中性粒细胞的浸润量比较，在12h差异均具有统计学意义(P=0.007，0.000，0.000＜0.01)，在48hLDFK组与DDFK组角膜内中性粒细胞的浸润量比较差异有统计学意义(P=0.009＜0.01)；对相同时间点LLFK组与DDFK组、LLTrauma组及DDTrauma组角膜内中性粒细胞的浸润量比较，在12h及24h差异均具有统计学意义(P=0.023，0.011，0.010＜0.05，P=0.000，0.000，0.000)，在48hLLFK组与DDFK组差异有统计学意义(P=0.001＜0.01)。
3．LDFK组、LLFK组、DDFK组角膜中巨噬细胞均在真菌感染后期大量浸润，于120h开始出现大量浸润。对相同时间点LDFK组与DDFK组角膜中巨噬细胞的浸润量比较，120h差异具有统计学意义(P=0.046＜0.05)；对相同时间点LLFK组和DDFK组角膜中巨噬细胞的浸润量比较，在12h，24h，48h，120h及168h差异均具有统计学意义(P=0.007＜0.01，P=0.002＜0.01，P=0.009＜0.01，P=0.007＜0.01，P=0.034＜0.05)，而对相同时间点LLFK组、LLTrauma组、DDTrauma组角膜中巨噬细胞的浸润量比较，在12h，24h无明显差异。
4．对LDFK组、LLFK组、DDFK组真菌性角膜炎内中性粒细胞及巨噬浸润量与角膜炎症反应程度进行Pearson相关分析，结果显示中性粒细胞及巨噬浸润量与角膜病变炎症严重程度呈正相关(r=0.192，0.454，P=0.019，0.000)。
5．相同时间点对LDFK组与DDFK组的角膜内真菌量计数进行比较，在24h差异具有统计学意义(P=0.018＜0.05)；相同时间点对LLFK组与DDFK组的角膜内真菌量计数进行比较，也是于24h差异具有统计学意义(P=0.030＜0.05)。
6．同一时间点对LDFK组与DDFK组的角膜组织内IL-1β的表达进行比较，差异无统计学意义；相同时间点对LLFK组与DDFK组的角膜组织内IL-1β的表达进行比较，于120h差异具有统计学意义(P=0.043＜0.05)。
结论：
光照时间延长，增加了真菌性角膜炎角膜内IL-1β的表达，促进了中性粒细胞及巨噬细胞的募集，虽然中性粒细胞及巨噬细胞数量增多，但细胞功能下降，故未增加真菌的清除率，加重了角膜感染的炎症，加重了角膜病变程度。
真菌性角膜炎是一种由致病真菌引起的致盲率极高的感染性角膜病变，其病变程度不仅与感染真菌的类别、真菌的毒力有关，也与宿主的抗真菌免疫反应有关。真菌性角膜炎角膜内中性粒细胞的募集是抵抗真菌最重要的防线[1]。中性粒细胞是真菌性角膜炎的关键免疫细胞。在感染早期大量中性粒细胞浸润角膜来杀灭真菌，同时过度的中性粒细胞浸润也会造成许多组织的损伤[2]。昼夜节律描述了一个以24h循环的方式振荡的生理现象。这些节律提供了适当的内稳态所需的临时框架。通过预测环境和内部的变化，细胞(和生物)可以有效地编程他们的生理任务。在细胞水平，昼夜节律起源于遗传因素(时钟基因)在自动调节转录翻译中反馈回路[3]。一项研究发现，延长光照时间明显延缓小鼠角膜上皮创伤后的再上皮化过程，并引起更多的炎症细胞的募集[4]。也有研究发现，斑马鱼幼体对细菌感染的先天免疫细胞应答是受光照调控的，光照时间延长促进了先天免疫细胞的募集[5]。真菌性角膜炎的病变程度与免疫反应息息相关，在不同光照条件下小鼠角膜的免疫反应尚未可知。在本研究中我们将探究在不同光照条件下，小鼠角膜真菌感染后的炎症反应情况。
目的：
研究真菌性角膜炎小鼠在不同光照条件下的角膜炎症反应情况。
材料和方法：
将207只小鼠随机分为三组，LD组(Light/Dark12h光照)69只，LL组(Light//Light24h光照)69只，DD组(Dark/Dark24h黑暗)69只，在不同光照条件下饲养14天，制作真菌性角膜炎模型(FK)171只小鼠及创伤模型(Truama)36只小鼠，使用9只FK模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组各3只)分别于造模前0h，及造模后12h、18h、24h、36h、48h、72h、120h、168h,和9只Truama模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组各3只)于造模后12h、18h、24h，均使用裂隙灯显微镜进行眼前段照相以及临床评分。使用81只FK模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组每个时间点各3只)分别于造模前0h，及造模后12h、18h、24h、36h、48h、72h、120h、168h,和27只Truama模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组每个时间点各3只)于造模后12h、18h、24h，处死小鼠后获取眼球，行免疫荧光染色角膜整铺片，以计算出在不同实验条件处理下和不同时间点的小鼠角膜中中性粒细胞和巨噬细胞的浸润量。使用27只FK模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组每个时间点各3只)分别于建立真菌性角膜炎模型后24h、36h、168h处死小鼠后剜取完整眼球进行HE染色。使用27只FK模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组每个时间点各3只)分别于建立真菌性角膜炎模型后24h、72h、168h处死小鼠后获取新鲜角膜组织，后用PDA培养基来培养角膜组织，进行角膜组织内载菌量的统计。使用27只FK模型小鼠(LD组，LL组，DD组每组每个时间点各3只)分别于建立真菌性角膜炎模型后24h、36h、120h进行冰上取材获取角膜，提取角膜组织蛋白后使用LuminexFLEXMAP3D系统检测细胞因子IL-1β的浓度变化。
结果
1．同一时间点LDFK组和DDFK组的临床评分比较，接种真菌后24h角膜病变的临床评分相比，差异具有显著的统计学意义(P=0.000)；同一时间点LLFK组和DDFK组的临床评分相比，接种真菌后18h，24h和168h角膜病变的临床评分相比，差异具有显著的统计学意义(P=0.000，P=0.000，P=0.022＜0.05)。
2．LDFK组、LLFK组、DDFK组角膜内中性粒细胞均在真菌感染早期大量浸润，于36h到达峰值，而后逐渐开始下降。对相同时间点LDFK组与DDFK组、LDTrauma组及DDTrauma组角膜内中性粒细胞的浸润量比较，在12h差异均具有统计学意义(P=0.007，0.000，0.000＜0.01)，在48hLDFK组与DDFK组角膜内中性粒细胞的浸润量比较差异有统计学意义(P=0.009＜0.01)；对相同时间点LLFK组与DDFK组、LLTrauma组及DDTrauma组角膜内中性粒细胞的浸润量比较，在12h及24h差异均具有统计学意义(P=0.023，0.011，0.010＜0.05，P=0.000，0.000，0.000)，在48hLLFK组与DDFK组差异有统计学意义(P=0.001＜0.01)。
3．LDFK组、LLFK组、DDFK组角膜中巨噬细胞均在真菌感染后期大量浸润，于120h开始出现大量浸润。对相同时间点LDFK组与DDFK组角膜中巨噬细胞的浸润量比较，120h差异具有统计学意义(P=0.046＜0.05)；对相同时间点LLFK组和DDFK组角膜中巨噬细胞的浸润量比较，在12h，24h，48h，120h及168h差异均具有统计学意义(P=0.007＜0.01，P=0.002＜0.01，P=0.009＜0.01，P=0.007＜0.01，P=0.034＜0.05)，而对相同时间点LLFK组、LLTrauma组、DDTrauma组角膜中巨噬细胞的浸润量比较，在12h，24h无明显差异。
4．对LDFK组、LLFK组、DDFK组真菌性角膜炎内中性粒细胞及巨噬浸润量与角膜炎症反应程度进行Pearson相关分析，结果显示中性粒细胞及巨噬浸润量与角膜病变炎症严重程度呈正相关(r=0.192，0.454，P=0.019，0.000)。
5．相同时间点对LDFK组与DDFK组的角膜内真菌量计数进行比较，在24h差异具有统计学意义(P=0.018＜0.05)；相同时间点对LLFK组与DDFK组的角膜内真菌量计数进行比较，也是于24h差异具有统计学意义(P=0.030＜0.05)。
6．同一时间点对LDFK组与DDFK组的角膜组织内IL-1β的表达进行比较，差异无统计学意义；相同时间点对LLFK组与DDFK组的角膜组织内IL-1β的表达进行比较，于120h差异具有统计学意义(P=0.043＜0.05)。
结论：
光照时间延长，增加了真菌性角膜炎角膜内IL-1β的表达，促进了中性粒细胞及巨噬细胞的募集，虽然中性粒细胞及巨噬细胞数量增多，但细胞功能下降，故未增加真菌的清除率，加重了角膜感染的炎症，加重了角膜病变程度。