论文部分内容阅读
目的:“Th1/Th2偏移”假说是哮喘发病的主要免疫机制,但近年的研究发现该学说不能完全解释哮喘的免疫学异常,提出哮喘是一种对过敏原免疫耐受缺陷性疾患,但尚无系列研究证明这种理论。本研究旨在分别应用腹腔注射地塞米松、卵白蛋白(ovalbumin,OVA)特异性免疫治疗以及两者联合治疗的方法建立哮喘大鼠免疫耐受模型,进而探讨不同干预措施重建哮喘大鼠免疫耐受的可能性及其机制。为临床上合理选择哮喘治疗方案提供理论依据。
方法:60只SPF级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(河北医科大学动物实验中心提供),适应性饲养一周后,随机分为生理盐水对照组(NS组)、单纯哮喘组(A组)、哮喘地塞米松治疗组(D组)、哮喘免疫治疗组(S组)、地塞米松和免疫治疗联合干预组(DS组)。每组均为12只。以卵蛋白腹腔注射致敏和雾化吸入激发制备大鼠哮喘模型。在哮喘模型基础上,D组在每次激发前30 min用水溶性地塞米松0.5mg/kg腹腔注射;S组于第33、35、37天在每次激发前30min分别经尾根部皮下注射OVA100mg、200mg、400mg外,其余步骤完全同A组;DS组在每次激发前30min,腹腔注射地塞米松和尾根部皮下注射OVA,剂量同D组和S组;NS组仅将OVA替换为等量生理盐水同步注射。采用动物肺功能仪检测各组大鼠气道呼气阻力;留取支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞计数和分类;采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验测定BALF和血清中IFN-γ、IL-4含量以及OVA特异性IgE(sIgE)的含量;苏木精-伊红染色观察气道病理改变;免疫组化法测定肺组织T-bet和GATA-3表达;用流式细胞仪方法检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例。
结果:
1.BALF中细胞组分:NS组BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞分别为(41.67±4.14)×105、(2.67±0.98)×105A组分别为(124.83±6.45)×105、(33.08±3.50)×105,D组分别为(69.33±5.01)×105、(6.42±0.90)×105,S组分别为(76.08±4.29)×105、(6.50±0.79)×105,DS组分别为(67.58±5.63)×105、(5.92±1.24)×105,干预组和哮喘组明显高于对照组(P<0.05)。D组和DS组之间无统计学差异。
2.肺功能及激发试验情况:同等剂量氯化乙酰胆碱(6.25μg/kg、12.5μg/kg、25μg/kg、50μg/kg)激发时平均呼气阻力(单位cm H2O·ml-1·s-1),A组分别为(12.50±0.62)、(37.40±0.68)、(65.95±2.37)、(91.11±0.61),NS组分别为(12.52±1.48)、(21.41±1.53)、(36.62±3.67)、(52.64±0.41),D组分别为(13.14±0.14)、(31.63±0.91)、(60.95±2.37)、(66.90±0.50),S组分别为(13.53±0.35)、(32.24±0.78)、(62.03±1.84)、(77.45±1.39),DS组分别为(13.47±0.32)、(29.50±1.23)、(56.47±1.35)、(66.53±0.99)。A组和干预组大鼠气道基本阻力高于对照组(P<0.05),经静脉注射乙酰胆碱后A组和干预组大鼠气道呼气阻力变化幅度高于对照组(P<0.05),显示造模成功。
3.肺组织形态学改变:肺组织中嗜酸粒细胞、淋巴细胞计数、支气管管壁面积/支气管管腔内周长(WA/Pi)和支气管平滑肌面积/支气管管腔内周长(ASM/Pi),哮喘组明显高于NS组(P<0.05),与A组比较,D组、S组、DS组上述4项指标均减少(P<0.05)。
4.肺组织 T-bet及GATA-3表达量比例(SP法):免疫组化显示,A组、D组、S组、DS组的T-bet表达量低于NS组(P<0.05);与A组比较,D组、S组、DS组的T-bet表达量增加(P<0.05)。GATA-3在A组、D组、S组、DS组的表达显著高于NS组,其差异有统计学意义(P<0.05);D组、S组、DS组的GATA-3表达量和A组比较,差异有统计学意义(P<0.05),D组和S组比较无统计学意义。
5.BALF及血清中IFN-γ、IL-4的含量:A组、D组、S组和DS组BALF及血清中IFN-γ水平均低于NS组(P<0.05),D组中IFN-γ水平则低于A组(P<0.05),S组和DS组较A组显著增高(P<0.05);A组、D组、S组和DS组BALF及血清中IL-4水平均高于NS组(P<0.05);D组、S组和DS组中IL-4水平则低于A组(P<0.05),且S组和DS组较D组降低显著(P<0.05),S组和DS组比较无统计学意义。
6.血清OVA特异性IgE的含量:A组、D组、S组和DS血清sIgE含量均高于NS组(P<0.05),D组、S组和DS组血清sIgE含量均低于A组(P<0.05),血清sIgE含量在D组、S组和DS组两两比较无统计学意义。
7.血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例:流式细胞术显示,A组大鼠血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例显著低于NS组(P<0.05);D组、S组和DS组大鼠血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例较A组显著增加(P<0.05),S组和DS组比较无统计学意义。
结论:
1.免疫耐受的破坏是哮喘发病机制之一。其中T淋巴细胞分化失衡及调节性T细胞功能缺失是诱导哮喘发病的重要因素。
2.地塞米松使哮喘大鼠IFN-γ表达下调,对Th2型细胞因子IL-4更加强烈的抑制,同时显著提高血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例,进而纠正Th1/Th2失衡。提示地塞米松诱导哮喘大鼠免疫耐受形成的机制可能与促进调节性T细胞增加有关。
3.OVA特异性免疫治疗使合成Th2型细胞因子IL-4减少、Th1型细胞因子IFN-γ增多,同时上调血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例,重建哮喘大鼠免疫耐受。提示OVA特异性免疫治疗可诱导原始T细胞向调节性T细胞转化。
4.肺组织中转录因子T-bet/GATA-3失衡表达与气道炎症病理改变密切相关,进一步证实免疫失衡与哮喘发病关系密切,是哮喘气道炎症形成的原因之一。