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背景：肺癌是目前发病率和死亡率都极高的恶性肿瘤之一，严重地威胁着人类的健康。其中，中晚期肺癌患者的预后较差，5年生存率低于15％。因此，早发现、早诊断、早治疗是肺癌治疗的关键。随着人们自我保健意识的提高，各种诊疗技术的发展，早期肺癌的诊出率也越来越高。手术是现今治疗早期肺癌的首选方式之一。但是，因为手术受创伤较大，心肺功能影响较明显等因素的局限，使得它不能适用于所有早期肺癌的患者。随着介入肺脏病学的发展，由于其创伤小、特异性好等特点，在早期肺癌治疗中的应用变得越来越普遍。光动力疗法、冷冻疗法、近距离放射治疗等是目前最主要的几种早期肺癌治疗的介入治疗方法。然而，若是单独使用上述介入治疗方法，因其各自存在的局限性（如治疗范围表浅、剂量相关性副作用等）的影响，导致无法对早期肺癌进行很好的治疗。本课题主要从细胞层面，探讨光动力疗法联合冷冻对肺癌的杀伤作用,初步探讨其中的作用机制。从而评估其作为早期肺癌主要介入治疗方式在未来临床应用中的可能性。课题分成以下三部分：第一部分：光动力疗法对肺腺癌A549细胞的杀伤作用的研究研究目的：研究光动力疗法对肺腺癌A549细胞的杀伤作用，并同时筛选第三部分实验所需的PDT实验参数。研究方法：培养肺腺癌A549细胞至对数生长期。分别以0mmol/L，0.1mmol/L，0.25mmol/L，0.5mmol/L，1mmol/L，2mmol/L，3mmol/L，4mmol/L的5-ALA浓度梯度给予光敏剂，孵箱内避光孵育4h后，再以0J/cm~2，5J/cm~2，10J/cm~2，20J/cm~2的强度梯度给予630nm红光进行照射，照射后继续避光培养20h。行MTT检测各组细胞的增殖情况。结果：MTT检测结果显示，在单纯给予光敏剂的情况下，各组细胞OD492值无明显变化。在单纯给予红光照射时，低强度的光照（≤10J/CM~2），各组细胞OD492值无明显变化；而当光照强度达到20J/CM~2时，检测所得OD492显著低于对照组（P<0.01）。在一定范围内(≤10J/CM~2)，随着5-ALA浓度的增高，红光强度的增强，A549细胞OD492值降低（P<0.05）。结论：1、在避光时，光敏剂5-ALA无细胞暗毒性。2、单纯给予低强度光照不会对肺腺癌A549细胞产生明显的杀伤作用，但当红光强度增加到一定程度时，会对肺腺癌A549细胞造成明显的杀伤。3、一定范围内，PDT对肺腺癌A549细胞的杀伤作用，随着光敏剂浓度、光照强度的增加而增强。4、筛选出的第三部分实验所需PDT的实验参数：红光强度：5J/cm~2，5-ALA浓度：1mmol/L。第二部分：冷冻对肺腺癌A549细胞的杀伤作用的研究研究目的：研究冷冻对肺癌A549细胞的杀伤作用，并同时筛选第三部分实验所需的冷冻实验参数。研究方法：培养肺腺癌A549细胞至对数生长期。弃去培养基，分别置于-80内0min，1.5min，2min，3min，4min后，于37孵箱内复温5min。再加入培养基，于孵箱内继续培养24小时，行MTT检测各组细胞的增殖情况。结果：MTT检测结果显示，随着肺腺癌A549细胞冷冻时间的延长，检测所得OD492值逐渐降低。当冷冻时间≥3min时，实验组OD492值与对照组比较，出现显著差异（P＜0.01）。结论：1、随冷冻时间延长，肺腺癌A549细胞的细胞生存率逐渐降低。2、冷冻时间达到3min时，以上改变尤为明显。3、筛选出第三部分实验中冷冻的实验参数：-80冷冻2min。第三部分：PDT联合冷冻对肺腺癌A549细胞协同杀伤作用及机制初探研究目的：探讨光动力疗法联合冷冻对肺癌A549细胞的杀伤作用，并初步探讨其作用机制。研究方法：将肺癌A549细胞培养至对数生长期后，随机分成空白对照组、PDT组、冷冻组、联合组。各组给予不同的处理后，行MTT检测各组细胞的增殖情况；行流式细胞法检测各组细胞凋亡情况；行Western blotting检测相关凋亡蛋白及HSP90、HSP70表达情况；并采用Realtime-PCR技术检测各组中HSP90及HSP70的mRNA相对表达量。结果：MTT检测结果显示，联合组所测得OD492值显著低于空白对照组、冷冻组及PDT组（P＜0.01）；再行析因分析显示，联合组中PDT与冷冻存在显著交互作用（P＜0.01）。流式细胞法检测各组细胞凋亡率分别为，空白对照组：7.29%0.278%，PDT组：18.01%1.12%，冷冻组：22.7%3.07%，联合组：45.3%4.28%。联合组凋亡率显著高于空白对照组、冷冻组及PDT组（P＜0.01），且联合组中PDT与冷冻存在显著交互作用（P＜0.01）。Western blot技术检测结果显示联合组中肺腺癌A549细胞内Bad、ERK及P38蛋白表达量较其余各组均有明显增加；而联合组中HSP90、HSP70蛋白表达量均降低。Realtime-PCR检测结果显示联合组中HSP90、HSP70mRNA的相对量与空白对照组相比，明显增高，具有显著性统计学差异（P＜0.01）。结论：1、PDT联合冷冻对肺腺癌A549细胞具有协同杀伤作用。2、PDT联合冷冻可显著促进肺腺癌A549细胞的凋亡,降低细胞生存率。3、PDT联合冷冻杀伤肺癌A549细胞时，通过抑制HSP90、HSP70的表达，从而促进细胞凋亡，导致细胞生存率的降低。4、根据Realtime-PCR结果,推测该协同杀伤作用，主要是通过影响HSP90、HSP70的蛋白稳定性，降低其表达量，从而促进肺腺癌A549细胞的凋亡，产生协同杀伤作用而实现的。而并不是通过降低基因表达减少相应蛋白的翻译来完成的。通过上述研究，得到结论如下：1、PDT联合冷冻对肺腺癌A549细胞具有协同杀伤作用。2、PDT联合冷冻可显著增加肺腺癌A549细胞的凋亡率。3、PDT联合冷冻通过影响HSP90、HSP70蛋白的稳定性，导致其蛋白表达量降低，从而促进肺腺癌A549细胞凋亡,降低其生存率。