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类过敏反应是药物初次进入体内即可导致的类似过敏反应的一类药源性疾病。根据目前对类过敏反应的认识,其发生机理主要是药物直接刺激肥大细胞释放血管活性物质,或通过激活补体释放过敏毒素间接刺激肥大细胞释放血管活性物质,后者引起平滑肌痉挛、局部或全身毛细血管扩张、血压下降、循环衰竭等一系列的生理病理变化。在此过程中,肥大细胞是最重要的终末效应细胞。
迄今为止,对类过敏反应的认识大多来自于病例报道,通过实验研究,特别是通过动物模型的研究建立检测类过敏反应的指标的报道极少。
中药注射剂是从中药材中提取的有效成分制成的可供注入机体内的灭菌溶液或乳状液,以及供临床使用前配成溶液的无菌粉末或浓缩液。近年来,随着中药注射剂在临床的广泛应用,不良反应病例报道逐渐增多。过敏反应(包括过敏性哮喘、过敏性休克等)通常被认为是出现较多,危害较大的不良反应。近年来怀疑所谓的过敏反应中实际上也有一部分属于类过敏反应,后者不一定由过敏原引起,药物成分也可通过直接作用于肥大细胞和嗜碱性细胞,引起活性介质的释放,也可通过免疫机制的激活补体系统或其他通路引起该细胞释放生物活性介质,从而出现类似过敏的一系列症状,通常发生在注射药物后30min左右。
本研究根据目前对类过敏反应发生机理的认识及类过敏与过敏反应机理的区别,抓住两者的最终效应细胞-肥大细胞的脱颗粒现象以及颗粒中活性物质的检测,建立类过敏反应动物模型和体外细胞模型,探索建立用于预测和评估临床前中药注射剂引起不良反应可能性的测试指标组合。主要研究内容如下:
1 类过敏反应检测指标的研究
1.1 实验方法
选择健康雄性SD大鼠,分为空白对照组、眼镜蛇毒组、内毒素组和天花粉组四个组别。空白对照组不给药物处理,其余各组尾静脉注射相应药物眼镜蛇毒、内毒素和天花粉注射液。眼眶采集给药前和给药后0.5h、1h、2h、4h、12h、24h的血样,检测不同药物组给药前后不同时间点血清中的补体总活性、补体C3a、补体C4a、类胰蛋白酶、白三烯B4等指标。
1.2 实验结果
空白对照组在给药前后不同时间点的血清补体总活性、补体C3a、补体C4a、类胰蛋白酶和白三烯B4均没有没有发生显著变化。内毒素在给药后2h补体总活性显著下降,4h后逐渐上升至12h恢复正常,血清补体C3a、C4a含量在给药后2h显著上升,白三烯B4和类胰蛋白酶白含量也有相应时间段的上升;天花粉注射液补体总活性在给药后12h点有所下降,其它时间点均无明显变化,C3a含量在12h时有所上升,而C4a含量在给药前后不同的时间点均无明显变化,白三烯B4和类胰蛋白酶含量在给药后12h显著升高。眼镜蛇毒在给药后1h即出现补体总活性的下降,4h时迅速下降到12h-24h时达到低谷,血清补体C3a含量在给药后2h显著上升,白三烯B4和类胰蛋白酶含量也有相应时间段的上升,而C4a含量在给药前后不同的时间点均无明显变化。
1.3 实验结论
根据补体激活途径分析,实验结果显示眼镜蛇毒素和天花粉是通过补体旁路途径,而内毒素是通过MBL途径激活补体的,产生的补体C3a、C4a能导致肥大细胞脱颗粒释放血管活性物质,导致一系列的病理生理现象,是引起类过敏反应的物质基础。为下一步建立急性类过敏反应动物模型和应用于中药注射剂的质量控制奠定了基础。
2 大鼠类过敏反应模型的建立及其在中药注射剂质量控制上的应用研究
2.1 实验方法
选择健康雄性SD大鼠分为空白对照组、C48/80组、眼镜蛇毒组、内毒素组和天花粉组。尾静脉注射相应的药物,30min后观察症状表现,取血清检测补体总活性、补体C3a、补体C4a、类胰蛋白酶、白三烯B4等指标,取腹腔肥大细胞甲苯胺蓝染色观察并计数肥大细胞脱颗粒率,取肺组织做切片观察并计数肥大细胞脱颗粒率。用同样的试验方法进行中药注射剂组试验。
2.2 实验结果
2.2.1 SD大鼠类过敏反应模型的建立
给药后C48/80出现血压下降,腹腔和肺组织中肥大细胞脱颗粒率以及血清类胰蛋白酶和白三烯B4均有显著的增高。眼镜蛇毒、内毒素、天花粉在给药后30min,补体总活性、C3a、C4a以及类胰蛋白酶和白三烯B4含量均没有显著的变化,而天花粉和眼镜蛇毒在腹腔肥大细胞脱颗粒中有显著增高(P＜0.05)。
2.2.2 大鼠类过敏反应模型在中药注射剂质量控制中的应用研究
各中药注射剂组药物给药后30min,通过检测上述血清中补体总活性、C3a、C4a以及类胰蛋白酶和白三烯B4含量5个指标和腹腔、肺组织中肥大细胞脱颗粒率来评价其发生不良反应的可能性,结果显示为:灯盏花注射液、清开灵注射液和生脉注射液3种的补体C3a含量增高:腹腔肥大细胞脱颗粒率升高具有统计学意义的也有2种,即香丹注射液和清开灵注射液;肥大细胞脱颗粒的指标类胰蛋白酶和白三烯B4含量测定有统计学意义的有黄芪、葛根、清开灵和生脉4种;只有类胰蛋白酶含量显著增高的有脉络宁和甘草2种。
2.3 实验结论
C48/80给药后可直接激活肥大细胞使其脱颗粒释放类胰蛋白酶和白三烯B4等活性介质,引起血压下降,在类过敏反应模型中可作为阳性对照品。眼镜蛇毒、内毒素和天花粉在给药后30min,补体总活性、C3a、C4a均没有显著变化。结合在第一部分研究中补体系统激活的检出可能需要更长的时间,今后检测补体系统指标宜在给药后2h采样或者多点采样。上述结果表明一些中药注射剂可在体内直接或间接引起肥大细胞脱颗粒和释放活性物质。
3 体外肥大细胞脱颗粒试验在中药注射剂质量控制上的应用研究
3.1 实验方法
提取健康雄性SD大鼠的腹腔肥大细胞,将浓度为5×105/ml的肥大细胞悬液分为阳性对照组(CA8/80组),正常对照组(台氏液组),总酶对照组(细胞裂解液组)和中药注射剂组,每个组3个复管,每管200μl RPMC。37℃水浴10min后,各中药注射剂组加相应浓度的药物50μl/管,正常对照组加等量台氏液,阳性对照组加等量C48/80,总酶对照组加等量1％细胞裂解液。轻轻混匀各成分,37℃水浴45min后,每管取5μl细胞悬液涂片,甲苯胺蓝染色镜下计数肥大细胞脱颗粒率,细胞上清测β-氨基己糖苷酶释放率和类胰蛋白酶含量。
3.2 实验结果
阳性对照品C48/80的浓度与肥大细胞脱颗粒有一定的量效关系。对体外RPMC脱颗粒试验条件进行了优化,选择温度4℃,洗液用Hanks洗液,C48/80浓度为50μg/ml为相对最佳试验条件来进行中药注射液直接致MC脱颗粒的观察。
在MC脱颗粒率方面:1:5和1:10两个稀释度同时高于正常对照组且具有统计学意义的有参麦、脉络宁、清开灵和生脉4种中药注射剂,1:5高而1:10正常的有香丹1种中药注射剂,1:5和1:10同时低于正常对照组且具有统计学意义的有丹参和葛根2种中药注射剂;β-氨基己糖苷酶释放率方面:1:5和1:10两个稀释度同时高于正常对照组的有清开灵注射剂,1:5高而1:10正常的有甘草注射剂,1:5和1:10均低于正常对照组的有丹参注射剂;在类胰蛋白酶含量方面:1:5稀释度时高于正常对照组的有参麦、菌栀黄和清开灵3种注射剂,1:10时各中药注射剂组与正常对照组比较均没有显著的变化。
3.3 实验结论
在体外肥大细胞脱颗粒试验中,C48/80作为阳性对照药物是可靠敏感的;一些中药注射剂如清开灵注射液、生脉注射液等有较高的肥大细胞脱颗粒率,其意义有待于进一步研究。肥大细胞脱颗粒率增高的药物,其细胞上清中的指标β-氨基己糖苷酶、类胰蛋白酶并不都显著增高,其相关性有待进一步研究。上述结果表明一些中药注射剂确可在体外引起肥大细胞脱颗粒和释放活性物质。