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研究背景及目的:我国为乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染高流行区,约有2000～3000万慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）患者,由HBV感染所致的肝硬化和原发性肝癌占比高达77%和84%,给患者家庭和经济社会发展带来了沉重的负担。慢性乙型肝炎的治疗一直是临床热点、难点问题。HBV表面抗原（Hepatitis B surface antigen,HBsAg）清除往往预示着持续病毒抑制和宿主针对HBV的免疫功能恢复,被目前的国内外指南一致推荐作为慢性乙型肝炎功能性治愈（临床治愈）的标志。目前获批用于治疗慢性乙型肝炎的药物主要包括核苷（酸）类似物（Nucleos（t）ide analogue,NA）和聚乙二醇干扰素α（Pegylated interferon alpha,Peg-IFN-α）,单独使用NA治疗的患者,HBsAg清除率不足3%,而在此基础上序贯Peg-IFN-α治疗可显著提高NA经治慢性乙型肝炎患者的HBsAg清除率,且停药后1年仍有约70%～80%的患者维持功能性治愈。对于NA经治慢性乙型肝炎患者序贯干扰素治疗获得HBsAg清除、甚至停药后持久功能性治愈的影响因素,迄今为止尚未有系统的病毒和免疫动力学研究为之提供线索。此外,部分患者面临停用NA、序贯干扰素治疗过程中发生病毒学突破（Virologic breakthrough,VBT）进而导致疗效不佳、难以实现临床治愈的困境,亟需开展相关应用基础研究为临床早期预测病毒学突破、及时调整治疗策略提供依据。本研究依托规范化临床队列和生物样本库,系统评估了NA经治慢性乙型肝炎患者序贯干扰素治疗过程中病毒学和免疫学指标的动态变化,通过阐明方案下不同临床疗效患者,即实现治疗应答并保持停药后持久功能性治愈者,或发生病毒学突破而导致治疗失败者的病毒学和免疫学特征,旨在探索预测疗效的生物学标志物并揭示潜在机制,为进一步建立慢性乙型肝炎抗病毒疗效综合预测模型、优化旨在提高临床治愈率的多靶点联合治疗策略提供基础和依据。研究方法:在257例入组ANCHOR研究（NCT02327416）的NA经治慢性乙型肝炎患者中,于2014年3月至2019年6月完成96周基于Peg-IFN-α的序贯治疗（前48周联用恩替卡韦,后48周单用Peg-IFN-α）及24周停药随访观察的80例患者纳入研究一和研究二。自基线至随访终点,每24周收集患者外周血,监测病毒学指标的动态变化;分别于基线和第48周收集患者肝脏细针穿刺标本,检测肝细胞内HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）水平;于治疗终点和随访终点收集患者外周血,评估HBV特异性CD8+T细胞、滤泡辅助T（Follicular helper T,Tfh）细胞和B淋巴细胞等免疫学指标的应答状态。相关定义包括:1.治疗应答:治疗终点实现HBsAg清除和（或）乙型肝炎病毒表面抗体（Hepatitis B surface antibody,HBsAb）出现;2.持续应答（即持久功能性治愈）:实现治疗应答且停药24周后仍维持HBsAg清除;3.病毒学突破:停用NA序贯Peg-IFN-α治疗过程中,HBV DNA水平较最低点升高超过1 log10 IU/m L。从2009年4月至2019年12月,自两项多中心、前瞻性、随机对照研究中入组166例序贯Peg-IFN-α治疗48周（前8周联用恩替卡韦）或96周（前48周联用恩替卡韦）的NA经治慢性乙型肝炎患者,纳入研究三。通过流式细胞术、免疫荧光染色动态监测患者外周/肝穿标本中单核/巨噬细胞表面Toll样受体2（Toll-like receptor 2,TLR2）、程序性细胞死亡配体1（Programmed cell death ligand 1,PDL1）的表达,CD8+T细胞表面程序性细胞死亡受体1（Programmed cell death receptor 1,PD1）的表达。分离患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,体外经干扰素刺激后,比较基线不同乙型肝炎病毒e抗原（Hepatitis B e antigen,HBe Ag）状态或不同乙型肝炎病毒核心相关抗原（Hepatitis B core-related antigen,HBcrAg）载量的患者其单核细胞TLR2、PDL1和CD8+T细胞PD1的表达差异。对经历Peg-IFN-α序贯治疗患者的PBMC进行TLR2激动剂和（或）PDL1阻断剂预处理,而后与HBV稳定复制细胞系Hep AD38体外共培养,分别评价上清液中HBV DNA的复制水平、抗病毒细胞因子的表达情况以及CD8+T细胞的功能。研究结果:纳入研究一和研究二的80例患者中,36例在治疗终点实现应答。与无应答者相比,应答者年龄明显偏低,且具有更低的基线HBsAg水平(2.652±0.072 vs 2.915±0.058log10 IU/m L,P=0.005),和治疗过程中更加明显的HBsAg和HBcrAg下降幅度。从基线至48周,仅在应答者观察到肝细胞内cccDNA水平的显著下降（0.279±0.072 vs0.131±0.042 copies/cell,P=0.003）。通过Logistic回归分析和受试者操作特征曲线下面积（Area under the receiver operating characteristic curve,AUROC）发现,患者年龄、基线HBsAg水平、基线至24周的HBsAg下降幅度以及24周的HBcrAg水平与治疗应答相关。结合患者年龄、基线HBsAg水平和基线至24周HBsAg下降幅度可以有效预测治疗应答,其AUROC为0.924（0.864-0.984,P＜0.001）,而进一步结合24周时HBcrAg水平,AUROC可提升至0.938（0.879-0.997,P＜0.001）。在36例应答者中,21例在随访终点维持持续应答。从基线至48周,仅在持续应答者观察到肝细胞内cccDNA水平显著下降（0.294±0.109 vs 0.088±0.033 copies/cell,P=0.007）。与非持续应答者相比,持续应答者在治疗终点时其HBsAg和HBcrAg水平明显更低,而HBsAb水平则明显更高。多因素分析结果提示,治疗终点时HBcrAg和HBsAb定量水平与停药后持续应答独立相关,其AUROC分别为0.697（0.512-0.882,P=0.047）和0.744（0.573-0.915,P=0.013）,二者联合预测时AUROC显著提升至0.822（0.684-0.961,P=0.001）。治疗终点HBcrAg＜4 log10 U/m L且HBsAb＞2 log10IU/L（HBVCure cr Ab模型）对停药后持续应答的阳性预测值为100%。治疗终点HBcrAg＜4 log10 U/m L且HBsAb＞2 log10 IU/L的患者,其HBV包膜蛋白特异性CD8+T细胞和B细胞比例停药后24周仍能维持相对稳定,Tfh细胞比例在停药后仍有明显升高,且这些患者在随访终点具有更高比例的HBV聚合酶特异性CD8+T细胞和CD86+CD19+B细胞。纳入研究三的166例患者中,33例在停用NA序贯Peg-IFN-α治疗的24～48周发生病毒学突破。与未突破患者相比,病毒学突破患者具有更高的基线HBe Ag阳性率和HBcrAg载量,其外周单核细胞TLR2的表达水平在12周时明显较低,外周CD8+T细胞PD1的表达则在12～24周显著上调。病毒学突破患者肝穿组织中浸润的PDL1+巨噬细胞和PD1+CD8+T细胞明显多于未突破患者,而TLR2+巨噬细胞的数量则明显减少。体外干扰素刺激后,HBe Ag阳性或HBcrAg＞5 log10U/m L的患者其单核细胞PDL1和CD8+T细胞PD1的表达明显上调;HBe Ag阴性或HBcrAg≤5log10U/m L的患者其单核细胞TLR2的表达显著增加。经历Peg-IFN-α序贯治疗患者的PBMC体外接受TLR2激动剂处理后,培养体系中（Interleukin,IL）-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、（Tumor necrosis factor,TNF）-α和IFN-γ的释放水平明显增加,与HBe Ag阴性患者相比,HBe Ag阳性患者IL-6表达的增幅更低,而IL-10表达的增幅则更高。PDL1阻断剂可明显促进患者,尤其是HBe Ag阴性患者的CD8+T细胞表达CD107a、Perforin、Granzyme B和IFN-γ。TLR2激动联合PDL1阻断的PBMC可显著抑制共培养体系中源自Hep AD38细胞的HBV DNA复制水平。结论:对于序贯联合固定疗程Peg-IFN-α治疗的NA经治慢性乙型肝炎患者:1.患者年龄、治疗早期HBsAg和HBcrAg水平及其下降幅度可以预测治疗终点的HBsAg清除和（或）HBsAb产生;2.治疗终点HBcrAg＜4 log10 U/m L且HBsAb＞2 log10 IU/L（HBVCure cr Ab模型）,可反映患者肝细胞内较低水平的cccDNA,以及随访期间更加持久的细胞和体液免疫应答,有助于识别易于实现持久功能性治愈、达到安全停药标准的患者;3.基线HBe Ag阳性或高载量HBcrAg是NA经治慢性乙型肝炎患者序贯Peg-IFN-α治疗过程中发生病毒学突破的危险因素。治疗早期单核细胞TLR2低表达、单核细胞和CD8+T细胞之间PDL1/PD1信号通路的增强可能介导了患者抗HBV免疫应答能力的不足及病毒学突破的发生。