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调节性T细胞(Regulatory T cells, Tregs)的功能是调节体内免疫反应的平衡,参与众多生物学过程,如器官移植排斥、自身免疫病、病毒感染等过程。研究表明,鸡CD4+CD25+细胞具有和哺乳类动物中调节性T细胞相似的特性。但鸡CD4+CD25+细胞在鸡的生物学过程如病毒感染,诱导免疫耐受等过程中的作用还未见研究报道,本研究制备了鸡CD25单克隆抗体,针对鸡CD4+CD25+细胞的特性以及其在传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)感染,免疫耐受诱导等过程中的变化进行了详细的研究。目前没有商业化的鸡CD25抗体,于是我们通过分析鸡CD25序列、表达CD25蛋白、免疫小鼠、细胞融合等方法制备了鸡CD25单克隆抗体,并通过Western Blot和流式细胞术检测了鸡CD25单克隆抗体及偶联荧光蛋白R-藻红蛋白(R-phycoerythrin, R-PE)后抗体的特异性。结果显示,鸡CD25单克隆抗体可以特异性识别鸡胸腺和脾脏蛋白中一条约23.5 kDa的条带,与在ExPASy上预测的鸡CD25蛋白大小一致；利用偶联R-PE的鸡CD25单克隆抗体检测刀豆蛋白A(ConA)刺激的外周血CD4+T细胞表面CD25表达,结果显示CD25表达显著上升。以上结果表明,本研究制备的鸡CD25单克隆抗体具有很强的特异性,且可以用于流式细胞术。为探究鸡CD4+CD25+细胞的特性,本研究通过流式细胞术分选出鸡CD4+CD25+细胞和CD4+CD25细胞,定量检测IL-2,IL-10和TGF-β mRNA表达量,结果显示,CD4+CD25+细胞中无IL-2表达,IL-10和TGF-β的表达水平显著高于CD4+CD25"细胞；同时,将CD4+CD25+细胞和ConA刺激的CD4+CD25"细胞共培养,发现CD4+CD25+细胞可以抑制CD4+CD25细胞的增殖。以上结果表明,CD4+CD25+细胞具有分泌抑制性细胞因子和抑制CD4+CD25细胞增殖的能力。为探究鸡CD4+CD25+细胞在IBDV感染过程中的变化,本研究分别用鸡IBDV超强毒Harbin-1株和弱毒Ts株感染四周龄无特定病原体(Specific pathogen free, SPF)白来航鸡,接种PBS的鸡作为对照组,取胸腺、脾脏、法氏囊以及外周血,分离淋巴细胞,流式细胞术检测CD4+CD25+细胞比例变化,并定量检测胸腺和法氏囊中细胞因子IL-10和TGF-β mRNA表达量。结果表明,病毒感染后法氏囊中病毒载量升高,超强毒Harbin-1载量在第3天达到高峰,随后下降,弱毒TS株载量在第4天达到高峰,随后下降；IBDV感染后,胸腺中的CD4+CD25+细胞数量迅速并且持续减少,脾脏中的CD4+CD25+细胞数量迅速减少,感染3-5天恢复到正常水平；外周血中CD4+CD25+细胞在感染后1-3天显著增多,4-5天逐渐下降并恢复到正常水平；无IBDV感染时,SPF鸡法氏囊中CD4+T淋巴细胞比例小于10%,且几乎检测不到CD4+CD25+细胞,在Ts感染后4-5天,法氏囊中有大量的CD4+T淋巴细胞浸润,且CD4+CD25+细胞占很大比例(44.3±7.4%)。同时检测到了IBDV感染组胸腺和法氏囊中IL-10和TGF-β表达量的上升。以上结果说明,IBDV感染后引起全身的炎症反应,CD4+CD25+细胞从胸腺和脾脏中迁出,经血液循环到达法氏囊发挥其抑制作用,这可能是IBDV致病机理的一种机制。为探究鸡CD4+CD25+细胞在免疫耐受诱导和维持过程中的作用,本研究使用了实验室先前建立的胚胎发育晚期血管注射外源蛋白诱导免疫耐受模型。本研究在鸡胚发育第20天血管注射牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)诱导免疫耐受,同时检测了CD4+CD25+细胞的数量变化,结果显示诱导免疫耐受过程中CD4+CD25+细胞的比例持续高于对照组；同时,本研究通过在鸡胚发育第16天血管微注射鸡CD25单克隆抗体建立了血液中CD4+CD25+细胞减少的动物模型；随后,利用该动物模型和免疫耐受模型相结合,在鸡胚发育第16天注射鸡CD25单克隆抗体后,再在第20天注射BSA,出孵后进行四次BSA免疫,同时ELISA检测鸡血清中对BSA特异性的IgY,IgM,IgA来反映免疫耐受水平,结果显示, CD4+CD25+细胞减少后,鸡对BSA的免疫耐受水平显著降低,表明CD4+CD25+细胞在鸡胚发育晚期注射BSA诱导免疫耐受过程中起着重要的作用。综上所述,本研究制备了鸡CD25单克隆抗体,揭示了鸡CD4+CD25+细胞的免疫抑制特性,在传染性法氏囊病病毒感染过程和免疫耐受诱导维持过程中的重要作用。这些研究结果为家禽免疫学、传染病学和免疫耐受的进一步研究提供了重要依据。