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目的:目前阿尔茨海默病(AD)的治疗药物主要有胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐、加兰他敏)和NMDA受体拮抗剂(美金刚)。但这些药物主要改善AD症状,不能从根本上阻止或逆转AD病情进展。中医根据AD的临床表现,将其归属于中医“痴呆”的范畴,历代中医在痴呆病的治疗中积累了丰富而宝贵的经验。近年来,有一定数量的临床研究根据中医辨证论治治疗AD,结果显示中医药治疗AD疗效可观。查阅这些临床研究,发现大部分研究治疗方法均是以中医补肾为主,故本研究将这些文献纳入进行Meta分析,系统评价中医补肾法治疗AD的疗效和安全性,为中医补肾治疗AD提供循证医学证据。目前AD治疗尚无特效药,且针对AD发病主要病理因素的A β而研发的候选药几乎以失败而告终。流行病学研究发现,西方发达国家AD的发病率呈下降的趋势,深究原因是由于西方发达国家重视对大脑血管健康的保护。近年来,在AD患者尸检中发现除了神经元细胞损伤外还广泛存在着毛细血管内皮的损伤。因此,从脑血管的角度入手,保护血脑屏障,转运清除脑内A β可作为新的一种研究思路。于顾然教授自拟“补肾益精方”在临床上治疗AD患者有确切的疗效,并且本课题组在前期体外研究中不仅证实了该方药血清对神经元有保护作用,还进一步证实了该方的单味药地黄的水煎剂也对神经细胞有保护作用。5-羟甲基糠醛(5-HMF)是传统中药熟地黄的有效成分。因此,本研究探讨5-HMF对A β1-42寡聚体诱导AD体外血脑屏障(BBB)模型损伤的影响及可能机制,以期为熟地黄治疗AD提供实验数据支持。方法:Meta分析部分:检索7大数据库,具体包括:中国知网(CNKI)、万方数据知识服务平台(Wan Fang,WF)、维普(VIP)、CBM、PubMed、EMbase 和 web of science,根据标题按照PICOS原则找出PICOS分别所对应的主题词和同义词,检索数据库,收集近10年相关文献。通过标题、摘要、全文进行筛查,选取符合纳入标准的文献,提取相关有效数据,采用Review Manager5.3软件、stata 12软件对研究结果数据进行meta分析。实验部分:1.CCK8法筛选A β1-42寡聚体对bEnd.3细胞损伤的接近半数抑制率(IC50)的浓度。2.MTT法筛选5-HMF安全有效作用浓度:MTT法检测不同浓度的5-HMF对A β1-42寡聚体诱导bEnd.3细胞的活性影响。3.Tunel联合DAPI染色观察5-HMF对A β1-42寡聚体诱导bEnd.3细胞凋亡情况。4.Western Blot 法检测凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Cyto-C、cleaved-caspase3、caspase-3、p-PARP、PARP)、紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-5)和转运蛋白(LRP-1、Pgp)的表达情况。结果:1.此次Meta分析共纳入11篇临床随机对照研究进行系统评价,评价结果为:中医补肾组在临床疗效、中医症候疗效、改善MMSE评分、ADAS-cog评分和ADL评分方面均优于对照组(P<0.05);在安全性方面,纳入的11篇临床研究有7篇出现不良反应,症状轻微能自行缓解。将出现的不良反应文献纳入Meta分析发现中医补肾组与对照组之间没有统计学差异(P>0.05),认为中医补肾法治疗AD可能是安全有效的。2.CCK8 检测结果:分别以 5uM、10uM、20uM、40uM、80uM A β1-42寡聚体损伤 bEnd.3细胞24h,发现80uM A β1-42寡聚体对bEnd.3细胞活性抑制率接近50%,与模型Aβ1-42寡聚体组相比,差异具有明显统计学差异(P<0.001)。3.MTT法检测结果:(1)1uM～400uM浓度范围内的5-HMF对bEnd.3细胞无毒损作用(P>0.05);(2)1uM、10uM 和 50uM 5-HMF 可以抑制A β1-42寡聚体对 bEnd.3细胞活性的损伤,差异均具有统计学意义(P<0.01)。4.Tunel联合DAPI染色结果显示:与control组相比,模型Aβ1-42寡聚体组细胞被红色荧光染色的细胞数量增多,细胞核体积也皱缩变小。不同浓度的5-HMF干预后,细胞被红色荧光染色的细胞数量减少,细胞核的体积皱缩数量也减少。5.Western Blot结果显示:(1)凋亡相关蛋白表达情况:bEend.3细胞经Aβ1-42寡聚体损伤后,促凋亡相关蛋白Cyto-C/β-actin、Bax/Bcl-2、cleaved-caspase3/caspase-3、p-PARP/PARP 比值升高,差异具有统计学意义(P<0.01),加入5-HMF干预后,它们的比值随着5-HMF的浓度升高而降低,差异均具有统计学意义(P<0.01)。(2)紧密连接蛋白表达情况:Aβ1-42寡聚体损伤 bEend.3 细胞后,Z0-1/β-actin、Occludin/β-actin、Claudin-5/β-actin比值降低(P<0.05),加入5-HMF干预后,5-HMF低剂量组和中剂量组的比值随着5-HMF的浓度升高而加大,差异具有统计学意义(P<0.05)。而高剂量组Z0-1/β-actin、Claudin-5/β-actin随浓度升高而有所下降(P<0.05),但比值仍高于模型组。(3)转运蛋白表达情况:bEend.3细胞经A β1-42寡聚体损伤后后,LRP-1/β-actin、Pgp/β-actin 比值降低,加入5-HMF干预后,它们的比值随着5-HMF的浓度升高而加大;差异均具有统计学意义(P<0.01),但Pgp/β-actin升高幅度不大。结论:1.经Meta分析得出中医补肾法可以改善AD患者记忆、认知功能及日常生活能力,且无明显的不良反应。但因纳入文献数量有限,总共纳入患者的数量较少,文献质量不高。因此,我们应该客观性看待此次Meta分析结果。2.一定浓度的5-HMF可以通过保护血管内皮细胞活性、抑制细胞凋亡、保护内皮细胞间的紧密连接蛋白和细胞膜上的转运蛋白来保护BBB正常生理功能免遭Aβ1-42寡聚体的破坏。