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转座子(Transposon),可在基因组上自由跳跃(复制或者移位)的一类DNA片段,其移动的过程被称为转座(Transposition)。包括I类逆转录转座子和II类DNA转座子。转座子的插入诱变研究在包括鱼类等动物的性状主要调控基因的选择方面、功能探索以及转基因等多个研究方面开展研究具有极大的潜力。本实验中的主要研究对象Tgf2转座子,是由本实验室研究发现的具备自主转座活性的DNA转座元件。本研究着重于提高该转座酶蛋白的入核效率进而提高Tgf2转座效率进行探讨,目的是人工干涉转座元件来提高转座效率,为外源基因整合并稳定表达建立理论基础,为鱼类插入诱变研究提供支持。我们构建了包含有Tgf2转座酶蛋白的pEGFP-Tgf2TP表达载体,及含有猿猴病毒40(Simian virus 40,SV40)大T抗原核定位信号(Nuclear localization sequence,NLS)的pEGFP-TP-SV40NLS转座酶质粒,来研究人工干涉转座元件能否提高入核效率及转座效率。将构建的转座酶质粒经共显微注射导入斑马鱼受精卵中,经体外培养后在胚胎发育不同时期用观察检测报告基因绿色荧光蛋白,并通过测序检测阳性率。低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)在低氧反应中发挥着重要作用,其活性受到α亚基的调控。HIFs可以激活其下游对低氧敏感的一系列基因进行转录,从而调控包括能量代谢、红细胞生成、血管形成、细胞的增殖和凋亡在内的多种生理过程,以保证有机体在低氧环境下的稳态。目前关于HIF1α和HIF2α的在人、哺乳动物及鱼类中的研究较为深入,但对HIF3α的结构特点及其在低氧情况下的调控机制研究较少。我们希望通过探究团头鲂(Megalobrama amblycephala)HIF3α的结构及其低氧功能来探索出其不耐低氧的调控机制,进而为以后培育耐低氧团头鲂新品系服务。为此我们构建了包含有团头鲂HIF3α基因的表达载体pCS2-HIF3α-EGFP,来研究HIF3α蛋白在常氧和低氧的核定位分布情况,并通过检测团头鲂HIF3α在蛋白水平的表达情况,以期寻找其低氧调控机理,为团头鲂耐低氧研究提供理论基础。我们的研究结果如下:(1)通过将pEGFP-Tgf2TP和pEGFP-TP-SV40NLS转座酶质粒分别转染进入HeLa细胞,我们发现pEGFP-Tgf2TP-SV40NLS重组转座酶蛋白的绿色荧光多集中于细胞核分布,与瞬时转染pEGFP-Tgf2TP转座酶质粒的对照组细胞比较,入核效率达到51.63%,比对照组提高了11.58%,说明SV40NLS可以帮助提高入核效率。显微注射pEGFP-TP-SV40NLS转座酶质粒的斑马鱼阳性率达到了60.8%,相对于对照组48.1%的阳性率提高了12.7%,说明SV40NLS可以帮助提高整合效率。(2)团头鲂HIF3α隶属于bHLH家族,具有该家族特有的PAS、PAB、PAC、ODD、TAD结构域。经HeLa细胞转染后发现,常氧和低氧条件下,团头鲂HIF3α蛋白都集中于细胞核分布,低氧处理会导致检测组织中团头鲂HIF3α蛋白水平表达量显著增加。此外,团头鲂HIF3α蛋白的C-端具有一段核定位信号序列,可以帮助其进入细胞核在低氧下发挥功能。