OAZI-1结合与提呈肿瘤抗原能力的实验研究

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目的:检验OAZI-1能否有效结合肿瘤抗原,如果能够结合,OAZI-1/肿瘤抗原复合物能否通过促进肿瘤抗原提呈而在实验动物体内诱发抗肿瘤免疫效应。  方法:  (1)分别克隆获得小鼠OAZI-1基因和Melan-A基因的编码序列,构建pcDNA3.1(-)/OAZI-1、pcDNA3.1(-)/Melan-A、以及pcDNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1基因融合质粒。  (2)用pcDNA3.1(-)-OAZI-1真核表达质粒稳定转染H16-F1黑素瘤细胞,收集培养细胞并制备细胞裂解液,用OAZI-1多克隆抗体和Melan-A的单克隆抗体进行蛋白质免疫共沉淀实验。  (3)以上述构建的真核质粒作为基因疫苗免疫BALB/c小鼠,随后每10天进行一次加强免疫,共三次,最后一次免疫10天后分别制备小鼠脾细胞及收集小鼠血液。  (4)用淋巴细胞分离液从脾细胞中分离淋巴细胞,并用流式细胞术测淋巴细胞亚群。  (5)将上述制备的脾细胞与B16-F1细胞共培养后,用LDH释放分析法检测脾淋巴细胞的肿瘤杀伤活性。  (6)采用ELISA分析法检测血清中细胞免疫相关因子INF-γ和IL-4的水平。  结果:  (1)成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)/OAZI-1、pcDNA3.1(-)/Melan-A、以及pcDNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1。  (2)免疫共沉淀分析证实,OAZI-1具有与肿瘤抗原melan-A结合的能力。  (3)通过流式细胞术比较了免疫小鼠脾脏淋巴细胞亚群CD4+T细胞和CD8+T细胞相对数量的变化,实验结果显示,上述三种基因疫苗接种小鼠后,CD4+T细胞比率显著性升高,其中以pcDNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1免疫组和pcDNA3.1(-)/Melan-A免疫组升高更为明显(二者之间无显著性差异);与之类似,上述三种基因疫苗接种小鼠后,CD8+T细胞比率也显著性升高,但以pcDNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1免疫组升高最为显著,与所有其它组相比均有显著性差异。  (4) LDH释放分析发现,用pcDNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1和pcDNA3.1(-)/Melan-A免疫小鼠能显著增加脾淋巴细胞的肿瘤杀伤活性,其中以前者更为明显。  (5) ELISA结果显示,上述三种基因疫苗免疫小鼠后,仅pcDNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1组小鼠血清中抗肿瘤细胞因子IL-4及INF-γ含量显著性升高。  结论:本研究初步表明,OAZI-1具有与肿瘤抗原结合的能力,并能通过促进肿瘤抗原提呈增加实验动物体内的抗肿瘤免疫能力。本研究结果可为肿瘤防治提供新的思路与途径。
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