研究背景及意义退变性腰椎间盘突出症(Lumber disc herniation,LDH)是经常伴有严重的腰腿痛一种综合征,是脊柱外科常见病、多发病,常影响患者生活和工作,严重者生活不能自理。目前临床治疗方案包括保守治疗和手术治疗,但国内外尚未有统一的治疗方案。因此有必要对LDH发生过程中的多种致病因素进行科学分析,以期对疾病的形成机制有更深入全面的了解,为临床治疗提供更多的有效选择。研究证实,腰椎间盘的退变过程与多方面有关,有化学性机制方面的,也有传统生物力学机制方面的,传统生物力学的改变可加速化学性机制方面的改变。退变性LDH所导致的疼痛症状与神经根受压无相关性,而与炎症性反应密切相关,动物实验亦证实,髓核具有较强致炎作用。局部炎性环境下,骨髓腔内的血窦发生血管芽,导致进入软骨终板的血液减少,切断了椎间盘获得营养成分的主要途径,引起椎间盘退变。炎症环境的持续存在,破骨细胞数量的增多和功能的亢进,使骨重塑过程的动态平衡被打破,骨质流失严重,引起一系列的临床病症,包括骨质疏松、矿物质和骨代谢紊乱等等。同时由于破骨细胞活化,骨量丢失,骨小梁变细,强度降低;由于单个骨小梁因受力过大而形成微骨折,从而影响椎体松质骨、纤维环和无血管的髓核之间的液体互换状态,进一步破坏髓核营养供养的通路,加速了椎间盘的退变。在临床上,退变性腰椎间盘突出患者影像学检查我们常常会发现有椎体或终板的破坏,这改变了临近节段脊柱的生物力学结构,导致各种各样的问题,最常见的是反复下腰痛。但退变性腰椎间盘突出和椎体或终板破坏是否具有相关性,目前还没有相关研究。为了在椎体或终板破坏发病机制与治疗方面寻求突破,本实验对破骨细胞进行了重点研究。但是破骨细胞在退变性LDH中如何被激活,如何发挥其病理作用的机制目前还不明确。在炎症性环境影响下,破骨细胞的数量及活性都有不断增加。破骨细胞起源于骨髓单核-巨噬细胞谱系细胞,在体内必须通过基因调控分化发育为多核的成熟破骨细胞。活化的信号通路主要由免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)、核因子KB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)介导,也包括由一些细胞因子、生长因子等组成的非经典通路。目前认为最直接活化破骨细胞的内源性分子是激活RANKL(核因子NF-κ B受体的配体)。RANKL通过和存在于破骨细胞膜上的膜蛋白受体RANK结合,募集形成一种复合体(TRAF6和c.Src复合体),从而激活下游信号通路,如:NF-κB、J3、MAPK和Ca2+通路,通过胞内信号传导途径转而激活NF-κB、激活蛋白1等,激活破骨细胞相关基因(抗酒石酸碱性磷酸酶,金属基质蛋白酶9,整合素和组织蛋白酶K)的表达,促进破骨细胞分化、增强破骨细胞的骨吸收活性,抑制细胞凋亡,最终导致破骨细胞数量增多且功能亢进。细胞内的microRNA(miRNA)是一类自然出现的,包含20-22个氨基酸的非编码的内源性RNA。在真核生物内其通过对靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’untranslated regions,3’UTR)进行识别和结合,在转录后水平影响相关基因的表达。随着越来越多的miRNA被发现,其生物学效应越来越受到重视。miRNA在众多骨性疾病中发挥着重要的调节作用,例如骨肿瘤,骨性关节炎,股骨头坏死等骨代谢相关疾病等。但microRNA-216(miR-216)的生物学功能较少得到关注,它首次发现于2007年,主要研究集中在胰腺癌中的病理表达变化。目前虽然一系列研究表明破骨细胞在退变性腰椎间盘突出症中扮演重要角色,但是miR-216在破骨细胞分化过程中的表达与功能改变情况知之甚少。本实验通过对临床手术后退变性腰椎间盘突出症患者突出程度进行分类,分析临床特点,发现椎间盘突出程度与疼痛症状持续时间及工作性质有关,同时发现退变性间盘突出程度越重,出现椎体或终板破坏的几率越高。通过检测术后髓核内miR-216表达水平,发现有椎体或终板破坏的髓核内,miR-216表达水平降低。通过体外实验诱导单核细胞分化为破骨细胞,发现在破骨细胞分化过程中miR-216表达下降;miR-216通过靶向RANKL-RNAK-NF-κb信号通路调控破骨细胞的分化。本实验通过miR-216为中心环节,发现在退变性椎间盘在突出过程中,通过miR-216表达下降,解除了对破骨细胞的抑制,是造成椎体或终板破坏的原因之一。同时,随着椎体或终板破坏,椎间盘与椎体之间的物质交换通道进一步被破坏,并且随着损伤时间延长(疼痛持续时间)以及劳动强度的增加,患者积累性损伤也增加,即在生物力学及化学性方面的相互作用下,椎间盘的退变进一步加重,从而形成了恶性循环。所以研究miR-216的靶基因和它的生物功能方面的机制对于退变性腰椎间盘突出症的患者来说有着临床价值,对退变性腰椎间盘突山症的治疗和预防具有巨大潜力;我们希望,随着研究的深入,我们能够有更多的发现,为临床治疗的新突破提供更有效的靶点。第一部分研究目的:探讨退变性腰椎间盘突出症患者退变性椎间盘突出程度与临床特点之间的关系、退变性椎间盘突出程度与髓核内的miR-216表达水平之间的相互关系,阐明椎间盘退变程度与临床特点之间的关系,同时检测miR-216在退变性腰椎间盘突出患者髓核内的表达情况。研究方法:本研究入选192例手术患者,依据AAOS&ISSLS分类及Pfirrmann分级,结合CT和MRI分组:腰椎间盘膨出组,腰椎间盘突出组,腰椎间盘脱出组,记录各病例的临床特点,如性别、年龄、职业、疼痛程度、病程进展情况、血糖情况等,依据患者影像学结果观察患者椎体或终板破坏情况,同时观察不同组间患者临床特点的改变情况;对照正常组29例,均为年轻,急性暴力外伤,MRI检查无间盘退变;保留切下有椎体或终板破坏的所有患者的髓核,利用qRT-PCR、Western blot、荧光素酶实验等技术,检测miR-216在正常与退变性LDH患者髓核内的表达改变情况;研究结果:依据AAOS&ISSLS分类及Pfirrmann分级,结合CT和MRI等影像特点:椎间盘突出程度,椎间盘压迫征象如硬膜囊、神经根受压、硬膜外脂肪变形、移位或消失等,还有间盘的信号改变,间盘结构的改变,间盘髓核与纤维环边界清晰与否,椎间隙的高度的改变情况,将患者分为腰椎间盘膨出组36例,腰椎突出组117例,腰椎脱出组39例,对照组27例。患者疼痛症状出现到手术的持续时间,膨出组与突出组和脱出组相比具有显著统计学差异(p<0.05);与椎间盘膨出组相比,从事体力劳动患者的比例在椎间盘突出组与椎间盘脱出组中更高(p<0.001)。观察患者CT及MRI影像,发现患者间盘膨出组椎体或终板破坏占2.8%,突出组占84%,脱出型占95%,各组间P<0.01,具有统计学意义。通过qRT-PCR实验检测有椎体或终板破坏的退变性腰椎间盘突出症患者髓核以及其他外伤性患者髓核标本中,miR-216表达量的变化情况。实验结果显示,相较正常对照组,退变性腰椎间盘突出症患者髓核中,miR-216表达水平低。研究结论:1.疼痛症状持续时间与退变性椎间盘突出程度呈正相关;2.劳动强度高者,椎间盘退变程度重;3.退变性椎间盘突出程度重者,椎体或终板的破坏几率增高;4.有椎体或终板破坏的椎间盘突出患者髓核组织中miR-216表达下调。第二部分研究目的:体外诱导单核细胞分化为破骨细胞的过程中,观察miR-216与破骨细胞内关键蛋白之间的相关性,明确miR-216在破骨细胞生成过程中的调节作用及其分子生物学机制,以期为临床治疗提供新的治疗方案。研究方法:测定正常健康供体,采用密度梯度离心法从外周静脉血分离出单核细胞,经诱导分化为破骨细胞并做细胞鉴定;分别取0,3,6,9,12天培养分化的破骨细胞,经Western-blotting检测破骨细胞内CALCR、CTSK、TRAP等蛋白的表达;分别取0,3,6,9,12天培养分化的破骨细胞应用Mir VanaTM miRNA Isolation提取试剂盒提取细胞MiRNA,去掉大分子RNA,经反转录反应合成cDNA,经实时荧光定量PCR扩增目的基因,并做相对量检测;分别取0,3,6,9,12天培养分化的破骨细胞,经细胞转染,经Western-blotting检测破骨细胞内RANK的表达及荧光素酶报告系统进行验证;将外周血单核细胞放入不同的培养基中进行破骨细胞诱导分化与加入MiR-216的培养基对比,并做破骨细胞鉴定;各培养组提纯小分子MiRNA,经反转录反应合成cDNA,经实时荧光定量PCR扩增目的基因,并做相对量检测;各培养组培养分化的破骨细胞,应用Western-blotting检测加入MiR-216与没有加入MiR216分化后的破骨细胞内CALCR、CTSK、TRAP等蛋白的表达。研究结果:1.体外诱导外周血单个核细胞分化为破骨细胞,通过Western blot检测CALCR、CTSK、TRAP等蛋白表达增高,TRAP染色亦证实破骨细胞分化形成;2.qRT-PCR检测显示miR-2J6表达在破骨细胞分化过程中表达下降,提示miR-216可能在破骨细胞的分化中发挥作用。3.体外诱导破骨细胞分化过程中,转染miR-216,Western blot及qRT-PCR验证了 CALCR、CTSK、TRAP等蛋白及核酸表达水平降低,TRAP染色亦证实破骨细胞分化被抑制4.细胞转染miR-216,Western blot及荧光素酶报告系统验证了miR-216可直接靶向RANK。5.Western blot检测显示p-NF-kB p65表达降低,提示miR-216通过调控RANKL-RNAK-NF-κ b信号通路下调破骨细胞的分化。研究结论:1.在破骨细胞分化过程中miR-216表达下降;2.miR-216通过靶向RANKL-RNAK-NF-κ b信号通路调控破骨细胞的分化。