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白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)含有树脂的心材称为“沉香”,健康的白木香不结香,只有通过各种胁迫才会结香,自然结香率低且时间漫长,而由于缺乏基因信息,人们对于结香的机理也并不清楚,所以通过人工诱导白木香结香来模拟自然结香过程从而研究结香机理成为了研究热点。白木香的结香类物质主要是倍半萜类和色酮类物质,本研究通过使用MeJA诱导白木香根探索产生倍半萜类次生代谢产物的过程,以期有助于大田人工结香技术的开发。1.目的本研究的主要目的是探索MeJA诱导白木香根产生倍半萜类次生代谢产物的过程,以期有助于大田人工结香技术的开发以及探索MeJA的诱导对白木香不同根材料的影响。2.方法本研究选取了白木香的气雾培根和组培根为材料,都使用100μmol/L的MeJA处理72h后,以未处理的根为空白对照,使用SPME-GC/MS检测不同根材料内倍半萜成分。然后,利用RNA-Seq技术获得了使用100μmol/L的MeJA处理白木香气雾培根0h、24h、48h、72h和组培根0h、72h后的六个转录组。先分析了气雾培根四个时间的转录组数据,重点挖掘了白木香气雾培根四个转录组中萜类合酶基因以及与倍半萜类物质生物合成相关的信号通路和转录因子,后比较了气雾培根和组培根在被MeJA诱导后根内差异基因的变化情况,以及倍半萜类成分和萜类合酶基因的变化情况.3.结果3.1 MeJA处理白木香不同根材料的化学成分变化情况SPME-GC/MS检测结果显示,MeJA处理白木香气雾培根72h后,根内化学成分比0h多出七种,分别为β-榄香烯、γ-衣兰油烯、α-葎草烯、α-姜黄烯、β-金合欢烯、α-愈创木烯、δ-愈创木烯；而MeJA处理白木香组培根72h后,根内化学成分比0h多出六种,分别为β-榄香烯、β-雪松烯、α-愈创木烯、β-金合欢烯、α-葎草烯、δ-愈创木烯。3.2白木香气雾培根的转录组数据分析3.2.1本研究筛选出了可能与倍半萜生物合成相关的两条早期信号通路：钙信号通路ko04020(Calcium signaling pathway)和丝裂原活化蛋白激酶信号通路ko04010(MAPKsignaling pathway)。并挖掘出钙信号通路上可能参与倍半萜类生物合成的8个关键基因(AsCML42,AsCML37、AsCML15、AsCML11a、AsCML13、AsCML2、AsCALM, AsCML11b)和MAPK信号通路上可能参与倍半萜生物合成的7个关键基因(AsMAPKK2、AsMAPKK6、AsMAPKK9、AsMAPK4、AsMAPK7、AsMAPKKK12、 AsMAPKKK9)。3.2.2挖掘出了只位于植物防御系统的上游,参与至少一条早期信号途径,而与萜类合酶基因没有显著相关性的13个转录因子,包括3个WRKY转录因子(AsWRKY43、 AsWRKY51b,AsWRKY23)、7个EREBP/AP2转录因子(AsERF21、AsERF17、AsERF113、 AsERF5、AsERF107、AsERF87、AsERF106)、2个bZIP转录因子(AsbZIPl、AsbZIP63)和1个bHLH转录因子(AsbHLH4)。3.2.3挖掘出了与萜类合酶基因有显著相关性的41个转录因子,其中,至少参与植物的一条早期信号途径的转录因子有27个,包括4个WRKY转录因子(AsWRKY75a、 AsWRKY70、AsWRKY40、AsWRKY2)、10个EREBP/AP2转录因子(AsRAP23a、AsERF4a、 AsERF25、AsERF23、AsERF2、AsERF12、AsERF109, AsCRF1、AsAP2、AsAIL6)、3个bZIP转录因子(AsbZIP61、AsbZIP43、AsbZIP4)和10个bHLH转录因子(AsbHLH93、 AsbHLH25、AsbHLH2、AsbHLH149、AsbHLH147、AsbHLH143、AsbHLH135b、 AsbHLH135a、AsbHLH130、AsbHLHl)。由此推测,使用MeJA刺激白木香根后,主要通过钙信号通路和MAPK信号通路激活相应的WRKY、EREBP/AP2、bHLH和bZIP转录因子,从而调控萜类合酶基因的表达,同时两条信号通路之间可能存在一定的交叉。3.2.4挖掘出了萜类合酶基因10个(alpha-humulene synthase1、germacrene-D synthase1、sesquiterpene synthase 1、sesquiterpene synthase2、sesquiterpene synthase 3、 Sesquiterpene Synthase4、germacrene D synthase2、alpha-humulene synthase2、terpene synthase 4、Delta-guaiene synthase).其中alpha-humulene synthasel和alpha-humulene synthase2可能与化合物α-葎草烯的产生有关,Delta-guaiene synthase可能与化合物α-愈创木烯、δ-愈创木烯的产生有关。3.2.5利用RT-qPCR技术在七个候选内参基因中筛选出了一个最稳定的内参基因UBC2,并随机挑选了7个目的基因进行了表达量验证,结果表明,7个目的基因通过RT-qPCR验证与转录组所测的表达趋势基本上是一致的,说明了转录组数据是可靠的。3.3气雾培根和组培根样品的数据比较分析比较了气雾培根和组培根在被MeJA诱导后根内差异基因的变化情况,发现使用MeJA诱导气雾培根24h或48h后,与空白对照相比,得到的差异基因的KGEE富集通路与MeJA诱导组培根72h后的差异基因KEGG富集通路中有较多条是重叠的,且代谢通路里发生变化的基因大多数也是一致的,由此推测,部分代谢通路在白木香气雾培根中比在白木香组培根中对MeJA的响应可能更为敏感。其中,萜类代谢通路上的萜类合酶基因也符合这一推测。通过数据分析,还发现虽然两种根材料响应MeJA诱导的时间不一样,但是激活的萜类合酶基因的种类绝大部分是一致的,因此,产生的倍半萜成分大部分也是一致的。4.结论本研究通过使用MeJA诱导白木香气雾培根和组培根不同的时间,获得了白木香根中各化学物质或基因变化的数据。通过对气雾培根样品4个转录组的深入分析,筛选出了一系列可能与倍半萜生物合成相关的基因,值得作为后续功能验证的候选基因,也为揭示MeJA调控白木香根中倍半萜类物质生物合成的分子机制提供了一定的参考信息。通过比较气雾培根和组培根的化学检测数据和转录组数据,发现不同的材料可能响应MeJA的敏感度不同,但产物是大体一致的,这可以为选材和诱导时间点的选择提供启发。