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目的:因先天性疾病、炎症、肿瘤及其他原因引起的气管广泛性狭窄而需行长段气管的切除与重建在临床上并不少见。但气管由于其特殊的解剖生理特点,当其切除长度超过6㎝时由于张力过大将无法吻合。为保持气道的畅通,各种方式的气道重建应运而生。目前有人工气管替代、自体组织代气管、生物医学与组织工程重建气管及气管移植。其中气管移植被认为是气管重建的首选方法。由于气管移植和其他器官一样具有免疫原性,移植后会发生免疫排斥反应。对于需要进行气管移植的患者来说,大多数是肿瘤患者应用免疫抑制剂不仅影响术后恢复,并可导致癌症复发。因而近年来深低温冻储后的气管移植备受瞩目。冷冻包括低温(高于- 80℃)、深低温( - 80℃)、超深低温( - 196℃)以及反复冻融等方法。冷冻后的组织可以保持其原有的活性和组织完整性,并能削减其免疫原性,这样既解决了供体的保存问题,又解决了移植后免疫排斥反应的控制问题。为了解超深低温(-196℃)条件下气管组织细胞的免疫原性及存活力,我们利用免疫组化方法观察大鼠气管组织的树突状细胞,以明确其免疫原性的变化;采用3H-TdR(3H-胸腺嘧啶核苷)体外培养的方法检测细胞活力。方法:48只SD大鼠,体重200-250g,购自河北医科大学动物实验中心。随机分为6组、将其中一组做对照组。切取2.5-3.5cm气管,切取其边缘,用免疫组化(OX-62标记)检测树突状细胞的表达,将气管段分别移入注满冷冻保护液的冻储管(2ml)中,每管中放一段气管,使冷冻保护剂充分浸润气管,旋紧管帽。放置于4℃冰箱中平衡4小时,采用程控降温仪程序降温,降温速率1℃/分,降至-80℃迅速投入液氮中保存。24小时,第10天、20天、30天、60天分别取出8只切取其边缘4-6个气管软骨环,经复温后与新鲜气管做比较,将剩余气管采用体外培养的方法分析细胞功能和活力,并检测树突状细胞的表达。组织病理采用石蜡切片HE染色观察,免疫组化采用SP法。应用SPSS13.0统计软件分析试验结果。结果:1对比冻储后的气管组织和新鲜组织的组织学检查。超深低温保存后的气管复温后和新鲜气管相比在外观无明显差别,稍显苍白。正常气管结构的HE染色可见气管黏膜表面排列整齐的假复层柱状纤毛上皮细胞,黏膜及黏膜下层基质细胞、腺细胞和血管内皮细胞保存完好。软骨部分结构致密,可见软骨细胞单独或多个生长于软骨陷窝内。冷冻后的各组气管结构基本保持完整,随着时间的延长部分出现纤毛脱落,上皮破坏,软骨变化不大。2对比冻储后的气管组织和新鲜组织的免疫组化结果,新鲜气管组织在气管冠状位切片可观察到上皮层内至基膜层组织有少量棕色深染的树突状细胞胞体分布,在上皮细胞层间为深浅不一的棕色染色,在粘膜下层混合腺中也有深染树突状细胞,平行气管长轴的基膜层切片可以观察到大量树突状细胞交织成网状,软骨层没有阳性染色。冻存后气管则组织水肿,树突状细胞肿胀,树突状突起着色淡染,突起远端着色不清,细胞分布稀疏。OX-62是大鼠树突状细胞比较特异的标志物,在正常新鲜组,其阳性表达共8例,其中强阳性6例,阳性1例,弱阳性1例;在冷冻后24小时,其阳性表达共8例,其中强阳性4例,阳性2例,弱阳性2例,阴性0例;在冷冻后10天,其阳性表达共8例,其中强阳性5例,阳性2例,弱阳性1例,阴性0例;在冷冻后20天,其阳性表达共7例,其中强阳性1例,阳性3例,弱阳性4例,阴性0例;在冷冻后30天,其阳性表达共5例,其中强阳性0例,阳性1例,弱阳性4例,阴性3例;在冷冻后60天,其阳性表达共1例,其中强阳性0例,阳性0例,弱阳性1例,阴性7例;结果显示,OX-62在冷冻24小时、冷冻10天与正常组相比差异不显著(P>0.05),OX-62在冷冻20天、30天、60天组表达显著低于正常组(P<0.05,且随着冷冻时间的延长,其表达逐渐递减。3 3H-TdR掺入率在冷冻前测定值为35.18±3.30CPM/mg,冷冻后24小时为28.39±3.20 CPM/mg,约占冷冻前的80%;冷冻后10天为26.28±2.62 CPM/mg,约占冷冻前的74%;冷冻后20天为25.05±2.85CPM/mg,约占冷冻前的71%;冷冻后30天为24.85±3.01CPM/mg,约占冷冻前的70.6%;冷冻后60天为24.59±2.44CPM/mg,约占冷冻前的65.2%。结论:1冻储气管的OX-62表达下降(≥20天),统计学意义相差显著,提示冻储气管的免疫原性降低可能是由于树突状细胞明显减少,其功能和活性降低,树突状细胞在冻储过程中受到了损伤。2 3H-TdR在细胞增殖过程中合成到染色体中,细胞死亡后不会吸收,因此可作为细胞活力的标志。通过对3H-TdR掺入率检测结果分析,气管低温保存后24小时其掺入率就明显降低,此后降低逐渐变缓。3综合我们的研究结果表明,通过检测冷冻后不同时段的树突状细胞表达及树突状细胞的变化以及冷冻后气管组织细胞的活力,发现冷冻60天的气管免疫原性最低,但气管组织细胞活力只有冷冻前的65%,冷冻24小时的气管组织细胞活力是冷冻前的80%,但免疫原性很高;综合比较后冷冻30天的气管不仅很大程度的降低了免疫原性,同时很大程度的保存了气管的存活力。