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目的:分别用GFP/RFP的整合布鲁氏杆菌M5/16M(以下简称GFP-M5和RFP-16M)侵染腹腔巨噬细胞(MΦ),检测白介素-2(IL-2)调节作用下,被GFP-M5和RFP-16M侵染的MΦ培养不同时间所释放的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、NO因子的含量;CFU测定MΦ内GFP-M5和RFP-16M的活菌数,并计算MΦ的吞噬指数,判断MΦ的吞噬及其杀菌能力;利用血球计数板和倒置荧光显微镜,计算荧光细胞数,以此来计算MΦ的吞噬率;台盼蓝染色检测不同浓度和时间点被侵染后MΦ的存活率;观察在不同时间点和不同浓度IL-2作用下,被侵染后MΦ的增殖变化;利用RT-PCR和凝胶电泳技术验证MΦ不表达并分泌IL-2;以此来探讨IL-2对MΦ在被GFP-M5和RFP-16M侵染后的免疫调节的作用,为临床运用IL-2及治疗布病提供新的思路和理论依据。方法:1、将正常的布鲁氏菌16M株与RFP-16M培养至对数期后收集菌体,用麦氏比浊管配置好所需菌液的浓度,依照细菌和细胞的比例为100:1进行侵染,利用平板计数法来比较正常细菌16M与RFP-16M在胞内的存活能力;2、利用ELISA试剂盒,按照说明书操作,通过酶标仪分别检测不同浓度IL-2和不同时间点作用下,被侵染的MΦ释放的TNF-α、IFN-γ、NO因子的含量;3、依据菌落形成单位(CFU)的方法,将不同浓度IL-2和各时间点作用下的被侵染细胞,用细胞裂解液裂解、PBS稀释,然后涂布于布鲁氏菌固体培养基,72h后进行菌落计数,计算各浓度、各时间点菌落数目和细胞的比例,得出MΦ吞噬指数;4、在血球计数板和光学显微镜下,观察不同浓度IL-2和各时间点作用下的被侵染的MΦ的增殖变化;结合台盼蓝染色法,计算细胞死亡数,以此计算MΦ存活率;5、使用血球计数板和激光共聚焦显微镜,根据GFP-M5和RFP-16M只在MΦ胞内表达荧光蛋白的特性,计数发光细胞数目和总细胞数目,从而计算MΦ吞噬率;6、提取MΦ的RNA,利用RT-PCR试剂盒,反转录出模板cDNA,经过PCR技术进行扩增,观察MΦ本身基因序列是否转录出表达IL-2的mRNA。结果:1、通过CFU结果显示,RFP-16M对比正常的布鲁氏菌16M在不同时间阶段的细菌,发现两者生长状况无明显的差异,说明pMC-221载体对细菌体侵染小鼠MΦ的能力无影响;IL-2促进了MΦ吞噬RFP-16M的能力,随着侵染时间的增长和IL-2浓度的增加,胞内活菌数降低,存在时间和浓度依赖性,说明了MΦ的杀菌能力逐渐增强(IL-2为0×10~6IU,0h时,菌落数858.667±48.222;IL-2为5×10~6IU,24h时,菌落数285.667±7.572);2、利用ELISA试剂盒,按照说明书操作,通过酶标仪检测发现IL-2调节被GFP-M5侵染的MΦ所释放的细胞因子(TNF-α、IFN-γ和NO)的含量(GFP-M5侵染,IL-2为5×10~6IU,12h与0h对比:123.902±13.249与11.092±3.152;67.083±26.675与5.346±0.835;14.779±1.899与3.256±0.269)与对照组相比均有显著性的提高(P<0.05),且存在一定的浓度和时间的依赖性;被RFP-16M侵染下,细胞释放IFN-γ和NO的含量与空白组(96.667±10.786与22.333±3.055;3.140±0.403与1.511±0.344)相比呈显著性的下降(P<0.05),TNF-α的含量与空白组相比(103.704±7.407与370.370±147.347)呈显著性的升高(P<0.05);3、正常条件下,MΦ的数目随着培养时间(T≤24h)的增长而逐渐增加的,在RFP-16M侵染后,随着IL-2浓度的不断增加,唯有2h的MΦ呈增长趋势,呈显著性差异(P<0.05),其余时间点,均呈下降的趋势,与对照组相比呈极显著性差异(P<0.01);同一浓度调节作用下,被侵染的细胞数目随着侵染时间的增加呈先升高后降低的趋势(IL-2为3×10~6IU,0h、2h、12h时,398.333±10.408;518.333±17.559;476.667±7.638),存在时间双向性;4、在IL-2的调节作用下,MΦ吞噬RFP-16M的吞噬指数、吞噬率随着侵染时间的增长(IL-2为3×10~6IU,12h,0.934±0.081)与空白组(2.192±0.123)相比均呈显著性的差异(P<0.05),且整体上呈下降的趋势,客观的证明了IL-2促进MΦ的活化,增强了其杀菌及其免疫调节的能力;5、在同一侵染时间点,与空白组相比,MΦ吞噬GFP-M5的吞噬指数不同浓度IL-2作用下,吞噬指数均呈显著性差异(P<0.05),且在2h,IL-2浓度为5×10~6IU时,吞噬指数达到最大值[12.486±0.339],高于相邻两组[4.458±0.157与1.558±0.076],极显著性高于对照组。表明IL-2的免疫调节功能明显的促进MΦ的吞菌能力,并存在浓度和时间上的依赖性;6、利用台盼蓝染色法发现,被RFP-16M侵染的MΦ数目在不同浓度调节下,随着侵染时间的增长,其数目(侵染12h,IL-2为3×10~6IU,61.383±3.177)与空白组(99.043±0.231)相比均极显著性下降(P<0.01);7、提取培养24h的正常生长状态下MΦ的RNA,利用RT-PCR试剂盒反转录出模板cDNA,通过PCR和凝胶电泳技术发现,MΦ本身并不分泌IL-2,表明本实验结果的差异,主要来源于外源IL-2的调节作用。结论:本研究结果表明,MΦ本身并不表达和分泌IL-2,本实验结果的差异,主要来源于外源IL-2的调节作用。IL-2可以促进MΦ活化,刺激MΦ使其分泌TNF-α、NO、IFN-γ因子的能力增强,参与抗布鲁氏菌的免疫应答,从而为临床运用IL-2研究及治疗布病提供新的思路和理论依据;IL-2能在一定程度上增强MΦ的吞噬能力和杀菌能力,在浓度和时间上存在依赖性及双向调节性,浓度过高时对细胞的噬菌(吞噬和杀菌)能力反而有一定的抑制作用,由于细胞的吞噬能力和杀菌能力的增强,导致了免疫反应中溶酶体的作用也增强,间接的引起了细胞的增殖和存活率也受到了IL-2浓度和布鲁氏菌侵染的影响。