论文部分内容阅读
以大黄鱼(Larimichthys crocea)性腺为材料,采用SMART(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)技术和DSN (duplex-specific nuclease)处理构建了大黄鱼性腺线性化cDNA文库,并从文库中随机挑取了3961个克隆进行测序,共获得3535条高质量的表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST)。序列经聚类分析后共得到2916条Unigene,包括415条contigs和2501条singletons。初步分析结果表明：该线性化文库的库容为4.3×106pfu/mL,文库重组率达95.8%,EST的非冗余率为82.49%, Unigene的平均长度为355 bp。经生物信息学分析,1785个为已知基因占总ESTs的61.21%；其中与性腺发育相关的基因66个,占已知基因的3.70%。微卫星分析发现共有129条EST序列含有149个微卫星重复序列,包括6条与性腺发育相关的ESTs。利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术分析了11个与性腺发育相关基因在大黄鱼性腺的表达情况。结果显示精巢特异性LRR基因(testis-specific LRR)只在大黄鱼精巢中表达(P<0.05)；雄性特异性致死3样1基因(MSL3L1),雄激素相互作用受体核蛋白激酶基因(ARINPK),精子发生凋亡相关蛋白基因(SARP),热休克蛋白70(HSP70)和细胞周期蛋白A1基因(cyclin A1)在精巢中的表达量高于卵巢(P<0.05)；相反,组织蛋白酶C基因(Cathepsin C),核自身抗原精蛋白基因(NASP)和细胞周期蛋白B1 (cycli B1)在卵巢中的表达量高于精巢(P<0.05)；促分裂原激活蛋白激酶1(MAPK1)和泛素C末端水解酶L5 (UCH-L5)在精巢和卵巢中表达没有显著差异(P>0.05)。在上述结果的基础上,利用SMART-RACE技术或RT-PCR技术克隆了大黄鱼性腺发育相关基因cyp19a、cyp19b、cyclin B1、CDC2、UBE2D和UBC9全长cDNA序列,其长度分别为1805 bp、2268 bp、1882 bp、1151 bp、798 bp和846 bp,可分别编码518、500、397、303、147和148个氨基酸的前体蛋白。利用qRT-PCR技术分析这些基因在大黄鱼各器官的表达情况,结果显示：cyp19a在卵巢中的表达量显著高于精巢(P<0.01),且cyp19a在精巢和卵巢中的表达均极显著高于其它各器官(P<0.01); cyp19b在端脑、中脑、下丘脑、脾和肝有较高表达量,在雄性大黄鱼的血中表达量最高。在性腺表达量极低。cyclin B1和CDC2基因在性腺中的表达量极显著高于其它各器官(P<0.01),且在卵巢中的表达量较精巢高(P<0.05)。UBE2D在脾脏和性腺中表达量较高,其它器官表达量较低,在性腺中的表达极显著高于其它各器官(除脾脏外)(P<0.01)。UBC9在性腺中表达量较高,且极显著高于其它各器官(P<0.01)。