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第一部分:自噬在大鼠移植肺缺血再灌注中的表达 目的: 建立大鼠左肺原位移植模型,观察自噬在肺移植(Lung Transplantation,LT)缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)中的表达,并观察自噬表达水平随再灌注时间的延长而发生的变化。 方法: 采用―改良三袖套吻合法‖建立大鼠原位左肺移植模型,将SD大鼠随机分为5组(每组6只):假手术组(S组)、移植再灌注2h组(Y2组)、移植再灌注6h组(Y6组)、移植再灌注12h组(Y12组)、移植再灌注24h组(Y24组)。S组术后2h,其余各组于再灌注后相应时间点取材,分别做以下检测:①透射电镜观察自噬体在各组肺组织中的表达。②免疫荧光技术检测自噬特异性标记物 LC3B的表达;③用 RT-PCR检测自噬相关基因 Beclin-1,Atg5的m RNA表达情况;④Western blot法检测自噬相关蛋白 Beclin-1,LC3B的表达情况。 结果: 1.形态学方面:①透射电镜:与S组相比,Y2组电镜下发现自噬体的存在;②免疫荧光检测:与S组相比,各移植组LC3B阳性细胞数进一步增多,以Y6组表达最多。 2.分子生物学方面:①RT-PCR检测:与S组相比,各移植组Beclin-1,Atg5的mRNA表达量均不同程度的增加(P<0.05),Y6组表达量明显高于其余各组(P<0.05);②Western blot检测:与S组相比,各移植组Beclin-1,LC3B蛋白表达均不同程度的增加(P<0.05),Y6组表达量明显高于其余各组(P<0.05)。 结论: 1.肺移植再灌注后自噬表达被激活。 2.自噬在肺移植再灌注后2h即有表达,且随时间延长,表达强度先升高再降低,并于再灌注后6h达到高峰。 第二部分:自噬在大鼠移植肺缺血再灌注早期中的作用初探 目的: 通过药物抑制和激活自噬,观察自噬对肺移植缺血再灌注损伤的影响,初步探讨其在肺移植LIRI中的潜在作用机制。 方法: 将SD大鼠随机分为8组(每组6只):假手术组(S组),假手术3-MA干预组(SM组),假手术BafilomycinA1干预组(SB组),假手术Rapamycin干预组(SR组),肺移植组(Y组),移植前3-MA干预组(M组),移植前BafilomycinA1干预组(B组),移植前Rapamycin干预组(R组)。各假手术组关胸2h后取材检测,各移植组再灌注2h后取材检测:①各组肺组织细胞自噬的表达情况。(检测方法及指标同第一部分)②酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法测定各组肺组织中 IL-1β,IL-10,TNF-α含量;③采用双抗体夹心 ABC-ELISA法测定各组肺组织中 MDA,MPO含量;④各组左肺静脉血气(PaO2、PaCO2、SaO2)、肺内分流(Qs/Qt)等肺功能指标;⑤各组左肺湿干比(W/D);⑥各组肺组织石蜡切片HE染色行病理学损伤程度评价。 结果: 1.与S组相比,SM组、SB组、SR病理学未见明显差异;肺功能指标,肺湿干比,炎症因子及氧化应激指标,Beclin-1,Atg5的m RNA表达,Beclin-1,LC3B的蛋白表达比较无统计学差异(P>0.05). 2.与S组相比,移植各组病理学损伤加重,肺功能指标,炎症因子等指标差异显著(P<0.05),肺损伤加重,说明肺移植LIRI模型成功。LC3B荧光信号表达增加,Beclin-1,Atg5的m RNA表达量增加(P<0.05),Beclin-1,LC3B的蛋白表达增加(P<0.05),说明移植各组发生自噬。 3.与 Y组相比,M组、B组 PaO2、SpO2降低,PaCO2、Qs/Qt增高,W/D比值升高(P<0.05),MDA、MPO、IL-1β、TNF-α含量均升高,IL-10含量降低(P<0.05);R组PaO2、SpO2升高,PaCO2、Qs/Qt降低,W/D比值降低(P<0.05),MDA、MPO、IL-1β、TNF-α含量均降低,IL-10含量升高(P<0.05)。 4.与Y组相比,M组和B组的LC3B荧光信号表达减弱,Beclin-1,Atg5的m RNA表达量减少(P<0.05),Beclin-1,LC3B的蛋白表达减少(P<0.05);R组LC3B荧光信号表达增强,Beclin-1,Atg5的m RNA表达量增加(P<0.05),Beclin-1,LC3B的蛋白表达增加(P<0.05)。 结论: 1.三种实验剂量的自噬干预剂不会引起假手术组的自噬强度变化,也不会直接造成肺损伤。 2.给予自噬抑制剂3-MA及BafilomycinA1后,肺移植再灌注早期细胞自噬表达被明显抑制,同时LT后的LIRI进一步加重。 3.给予自噬激活剂Rapamycin后,肺移植再灌注早期细胞自噬表达更加明显,同时LT后的LIRI明显减轻。 4.抑制自噬后,肺组织炎症反应和氧化应激反应增强,移植肺LIRI加重;激活自噬后,肺组织炎症反应和氧化应激反应减弱,肺移植LIRI减轻,提示调节炎症反应和氧化应激反应可能是自噬改善肺移植LIRI的机制。干预自噬有可能成为治疗肺移植LIRI的一个全新研究方向。