肿瘤细胞大多体现出异常增殖的细胞学行为。此外，肿瘤干细胞(cancer stem cells(CSCs))对肿瘤恶性进展的不良影响已被证实。CSCs的数量稀少，但其增殖、分化等细胞生物学行为对肿瘤的复发和转移具有重要的影响。能量代谢是细胞生命活动的基础。不同表型的细胞可能具有不同的能量代谢状态。研究表明，CSCs的代谢方式异于其分化的后代。对于肿瘤细胞尤其是CSCs来说，其代谢方式可随所处微环境因素变化而发生转变。不仅如此，肿瘤所处的微环境也极大地影响着细胞的各种生物学行为。动态研究微环境对细胞的各种生物学动态变化的影响有着极为重要的意义。　　微流控芯片在模拟肿瘤微环境用于细胞-细胞及细胞-细胞微环境相互作用的研究中富有广阔前景。此外，细胞的个体差异性往往表现为对同一刺激的响应程度、时间的差异，而荧光成像具有灵敏度高，实时分析的特点，因此适用于单细胞水平的实时动态分析。荧光实时成像结合微流控芯片肿瘤细胞模型用于肿瘤细胞生物学研究，对于获取细胞转化、运动过程中特定分子的变化信息极具优势。　　本论文以研究肿瘤细胞的增殖、分化中的重要转变过程为出发点，发展实时荧光成像的方法，动态追踪重要转变过程中的特定分子变化，并建立微流控细胞微环境模型，研究微环境因素变化对细胞生物学行为的影响。主要开展了以下工作:　　首先基于微流控芯片，综述了细胞生物学的体外研究相关进展，利用微流控芯片易于操控模拟体内微环境的特点，结合荧光实时成像高灵敏度的优势，开发针对肿瘤增殖、肿瘤干细胞分化相关的荧光实时成像方法，对这两个重要的细胞生物学过程中的特定分子进行实时追踪，并进一步结合到微流控芯片模拟肿瘤微环境的研究中，考察肿瘤微环境影响因素pH对肿瘤干细胞分化侵袭的影响。具体内容如下。　　先构建一种双靶标mRNA探针体系用于标记细胞周期G1期停滞，通过针对G1期停滞调控相关的两个关联基因MYC和CDKN1A mRNA的实时成像，实现对G1停滞的识别，并基于该成像方法研究了HIF-α在G1期停滞调控中的作用。该法可用于追踪单细胞内的动态变化，结果直观清晰，易于识别。绿色及红色荧光的空间和时间分布变化可用于指示不同阶段的周期停滞。我们将这种方法成功应用于研究HIF-1α在区分“良性”和“不良”细胞周期停滞中的作用，证明其应用于动态观察G1期阻滞的可靠性。　　接着以实时研究细胞能量代谢状态为目的，构建极化ATP探针，用于研究胶质瘤干细胞(GSCs)发生间叶性分化的能量代谢状态变化。通过实时监测活细胞内ATP的水平来反映是否发生能量代谢方式的改变;探针显示的亚细胞分布可反映细胞对氧化磷酸化和糖酵解途径的依赖性。线粒体共定位ATP成像荧光强度的增强现象提示，TGFβ的刺激能够增强GSCs分化期间的氧化磷酸化作用。GSCs依赖于氧化磷酸化代谢方式，并且这种依赖性在分化的细胞中丧失，但通过对比添加TGFβ诱导分化的细胞与单纯只由低含量FBS诱导分化的细胞发现，由TGFβ诱导分化发生较高比例的间叶性分化，这类细胞对氧化磷酸化的依赖有所增加。因此，我们通过能量代谢的荧光实时成像发现了间叶性分化GSCs相比其他分化的GSCs具有较高的氧化磷酸化依赖性;该法具有实时成像分析的特点，在研究处于不同阶段的细胞的能量代谢中体现出优势。　　最后基于微流控芯片平台构建三维细胞侵袭模型。在肿瘤干细胞单独培养及与血管内皮细胞共培养的情况下，由上述荧光成像方法辅助研究pH对肿瘤干细胞分化侵袭行为的影响。在我们的侵袭模型中，通过调节基质的硬度抑制了细胞以变形虫模式迁移，也正如我们观察到的，大多数侵袭的细胞表现出间充质样形态。在pH梯度下，我们发现发生侵袭的肿瘤细胞数量下降，且ATP产量降低。该结果表明了酸性应激不仅有助于维持肿瘤干细胞干性，而且让细胞处于低能量状态;而长期的低pH值处理将产生恶性程度更高的胶质瘤细胞。我们还发现，全反式视维甲酸(ATRA)在酸性pH的作用下将促进GSCs的凋亡，提示ATRA具备消除这些恶性胶质瘤细胞的治疗潜力。