【摘 要】
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目的:研究香青兰有效部位（effective parts of Dracocephalum moldavica,EPDM）对体外拟缺血再灌注损伤的人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells,HBMECs）的保护作用,探讨程序性坏死在香青兰有效部位抗氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/re-oxygen
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目的:研究香青兰有效部位（effective parts of Dracocephalum moldavica,EPDM）对体外拟缺血再灌注损伤的人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells,HBMECs）的保护作用,探讨程序性坏死在香青兰有效部位抗氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R）损伤中的作用及机制。方法:泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic acid protease,caspase）抑制剂Z-VAD-FMK联合OGD/R损伤建立HBMECs程序性坏死模型,以模拟脑缺血再灌注损伤后的程序性坏死过程。将HBMECs随机分为五组,对照组（Control）、Z-VAD-FMK联合OGD/R模型组（Model）、模型+EPDM低、中、高剂量组(25μg·m L-1、50μg·m L-1、100μg·m L-1)。（1）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞活力;试剂盒法检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）含量;Hoechst 33342/PI荧光双染检测细胞程序性坏死率;（2）显微镜法观察细胞形态;试剂盒法测定一氧化氮（NO）含量;Transwell法检测细胞迁移情况及单层内皮细胞通透性;免疫荧光检测血管内皮钙黏蛋白（VE-Cadherin）的表达情况,免疫印迹检测酪氨酸激酶（SRC）、内皮素-1（ET-1）、紧密连接蛋白Claudin5、内皮性一氧化氮合酶（e NOS）、及磷酸化e NOS的蛋白表达;（3）采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）探针、钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein AM）和JC-1探针分别检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）、线粒体膜通透性转化孔（mitochondrial permeability transition pore,MPTP）开放情况以及线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）;酶联免疫吸附实验检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）和白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）释放情况;免疫印迹法检测程序性坏死相关蛋白表达。结果:（1）与对照组比较,Z-VAD-FMK联合OGD/R模型组可使HBMECs活力下降,LDH释放增加,程序性坏死率升高（P＜0.01）;（2）与对照组比较,Z-VAD-FMK联合OGD/R模型组细胞形态变差,细胞迁移减少,NO释放量降低,单层通透性增加,VE-Cadherin表达减少,SRC、Claudin5、磷酸化e NOS表达减少,ET-1表达升高（P＜0.01）;（3）与对照组比较,Z-VAD-FMK联合OGD/R模型组ROS产生增多,MPTP开放,MMP降低,TNF-α、IL-1β以及IL-6释放增加,RIP3表达升高、PGAM5表达及p-MLKL/MLKL比值升高（P＜0.05）。而EPDM预处理可部分逆转上述因素的变化。结论:EPDM对脑缺血再灌注模型下的HBMECs具有保护作用,可减少细胞坏死率,促进细胞增殖、迁移,增强血管舒缩调节能力,并通过增强紧密连接和黏附连接维持屏障功能,相关机制为通过抑制RIP3/MLKL/PGAM5通路和MPTP开放以保护线粒体功能,进而使HBMECs免受脑缺血再灌注损伤,可为EPDM治疗脑缺血性相关疾病提供有价值的科学依据。
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