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克氏原螯虾(Procambarus clarkii Girard),属节肢动物门,甲壳纲,十足目,蝲蛄科,原螯虾属,又名红色沼泽螯虾,俗称淡水龙虾或小龙虾。据报道,克氏原螯虾虾肉中,蛋白质含量为58.5%,而脂肪仅为6.0%。近年来人们生活水平日益提高,摄取的食物种类也日益丰富。克氏原螯虾由于具有肉味鲜美、价格低廉以及营养丰富等诸多优点而日渐受到人们的青睐。同时它也是一种世界范围内的食用虾类,尤其是欧美国家将其视为珍贵的水产经济动物与美味佳肴,堪称国际贸易的重要水产品。诸多食品加工企业将其加工成冷冻虾仁,并向欧美等国家出口,此举广受当地消费者的欢迎。此外,克氏原螯虾虾壳也可用于提取甲壳素、几丁质等重要工业原料,甚至可以代替鱼粉用于水生经济动物的养殖。目前克氏原螯虾基本处于自然繁殖或人工捕捞的状况,尚未有十分成熟的人工育苗经验,故而几乎所有以经营克氏原螯虾出口业务为主的企业都面临着虾源严重不足的窘境。因此,对克氏原螯虾的繁殖生理和发育生物学进行研究,找出其繁殖和发育的内在调控机理,已成为目前迫切需要重视的问题。本研究首先采用正交设计法探讨了水温、养殖密度、饲料中的鱼粉黄豆粉比例这三个因子对克氏原螯虾生长以及卵巢发育的影响,拟为科学地人工养殖克氏原螯虾奠定基础。然后从本研究组前期构建的性早熟和对照组克氏原螯虾卵巢的正反交全长均一化消减杂交文库中选择了 13个可能与克氏原螯虾卵巢发育相关的候选基因,进行了筛选鉴定。最后从筛选出的关键候选基因中,选择C1q-like基因借助RNAi等技术进行了更深入的功能探讨,旨在丰富甲壳动物卵巢发育相关的分子机制及其调控机理。具体研究结果如下:1.环境和营养因子对克氏原螯虾生长以及卵巢发育的影响:以初始体重为8.97g±0.07g的克氏原螯虾青壳虾为研究对象,采用正交设计法探讨了水温(A)、养殖密度(B)、饲料中的鱼粉黄豆粉比例(C)这三个因子对克氏原螯虾生长以及卵巢发育的影响,每个因子设3个水平。结果表明:结合成活率、增重率、卵巢发育指数以及成熟率这4个指标综合考虑,选择A1B2C2(A因子1水平、B因子2水平、C因子2水平)作为最优克氏原螯虾饲养组合方案,即水温为22℃、养殖密度为20只/箱(水箱水体体积为65×45×22cm3)、饲料中鱼粉和黄豆粉比例为1:1;对于9g左右的小规格克氏原螯虾而言,25℃即可诱导其卵巢的提前成熟发育,其最适生长水温在22-25℃之间;饲料中动物蛋白含量过低或过高均不利于克氏原螯虾的生长,动物蛋白含量过低时,克氏原螯虾营养摄入不足,使得生长不佳,而当动物蛋白过高时致使氨基酸过量累积,并由此转入性腺中,促使克氏原螯虾卵巢过早、过快发育成熟,即造成性早熟。2.克氏原螯虾卵巢发育相关基因的筛选鉴定:为了从课题组前期构建的性早熟和对照组克氏原螯虾卵巢文库中筛选出与卵巢发育相关的基因,我们首先对13个潜在候选基因进行了 qRT-PCR验证,检测了其在性早熟及对照组克氏原螯虾卵巢中的差异表达情况,接着对潜在候选基因进行了时空表达谱分析。结果显示:R1-2、F68-4、R50、R11、F25-3、F42-4这6个基因在性早熟组中的表达量均显著低于对照组(P<0.05),且均在卵巢中高表达,而其他组织中不表达或表达量低,在卵巢不同发育时期的表达量均存在显著差异(P<0.05);R28-4、F14-6、R54、R9这4个基因在性早熟组的表达量与对照组差异不显著(P>0.05),但在在卵巢中均具有较高的表达,且在卵巢不同发育时期的表达量均存在显著差异(P<0.05);R5-5和R64-4在性早熟组的表达量与对照组差异不显著(P>0.05),在卵巢不同发育时期的表达量均存在显著差异(P<0.05),但在卵巢中的表达量较低;R51-2在性早熟组中的表达量显著低于对照组(P<0.05),但在卵巢中高表达,除了在Ⅲ期卵巢的表达量显著高于Ⅴ期之外,其在卵巢其他发育时期的表达量无显著差异。因此,初步推测这13个基因均与卵巢发育有一定的相关性。由于R5-5和R64-4基因在卵巢中的表达量较低,可能与卵巢发育的关系不是很大,因此认为,R1-2、F68-4、R50、R11、F25-3、F42-4、R51-2、R28-4、F14-6、R54和R9这11个关键候选基因值得进一步深入研究。3.克氏原螯虾C1q-like基因在卵子发生过程中的功能分析:序列比对显示,R1-2和淡水枝角类蚤状蚤的补体系统C1蛋白q样亚基编码序列C1q-like protein具有同源性,序列一致性达37%,因此将该基因初步命名为C1q-like。首先对克氏原螯虾C1q-like基因的部分cDNA序列进行了分析,发现其具有典型的C1q结构域,进化树构建结果显示其与淡水枝角类蚤状蚤的C1q-like聚为一支。然后利用qRT-PCR技术对C1q-like的组织表达谱进行了验证,结果发现,其在卵巢中表达量最高。接着采用RNAi等方法对其进行敲降,发现C1q-like敲降后,卵巢孕酮含量显著下调(P<0.05),肝胰腺卵黄蛋白原(Vg)表达量显著下调(P<0.05),卵黄蛋白原受体(VgR)表达量显著下调(P<0.05),说明C1q-like与卵黄积累、孕酮合成相关;孕酮注射结果显示,注射6h后,C1q-like基因的表达量发生极显著下降(P<0.01),12h和24h后呈显著上升状态(P<0.05)。而孕酮注射48h后,VgR的表达量也发生极显著下调(P<0.001),推测孕酮过高,又会抑制C1q-like、VgR的表达,起到反馈调节的作用;此外,C1q-like干扰后,包绕卵母细胞的滤泡细胞形态异常,发生融合,说明C1q-like对滤泡细胞形态与功能的维持也具有重要作用。以上结果表明,C1q-like在卵子发生中具有重要的作用,既可能通过刺激孕酮的合成而促进卵黄蛋白的合成,进而促进卵子的发生,又参与了滤泡细胞正常形态与功能的维持。