同期放化疗抵抗的鼻咽癌细胞外泌体长链非编码RNA表达谱分析

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:panxuanyu
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[目 的]本课题通过体外构建人鼻咽癌细胞同期放化疗模型,诱导建立鼻咽癌放化疗抵抗细胞株,并利用生物芯片检测和筛选出导致鼻咽癌细胞放化疗抵抗的关键外泌体lncRNAs分子,研究结果将为揭示外泌体lncRNAs在鼻咽癌细胞同期放化疗抵抗中的作用提供科学依据,具有重要的理论意义。为今后进一步寻找相关的临床干预措施以提高鼻咽癌放化疗疗效打下坚实的基础,具有较好的临床应用价值。[方法]1.选取鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2,采用大剂量同期放化疗连续冲击法,给予0.05μg/mL的顺铂和6Gy 6MV X-ray,反复处理共十次,诱导建立鼻咽癌CNE-1 CRR、CNE-2 CRR;2.采用平板克隆形成实验法鉴定鼻咽癌放化疗抵抗细胞株的抵抗性;3.利用差速离心法提取鼻咽癌细胞产生的外泌体并鉴定其大小,形态,标志蛋白和颗粒浓度与粒径是否符合外泌体标准;4.运用生物芯片技术分别检测CNE-1 CRR、CNE-2 CRR细胞株外泌体lncRNAs和它们各自母细胞株的外泌体lncRNAs差异表达水平,并根据生物芯片检测结果,筛选出同期放化疗抵抗的关键外泌体lncRNAs分子。[结 果]1.经同期放化疗共处理十次,成功构建体外鼻咽癌放化疗抵抗细胞株CNE-1 CRR、CNE-2 CRR 模型;2.利用平板克隆形成实验法已证实CNE-1 CRR、CNE-2 CRR细胞株与各自母细胞株对比具有放化疗抵抗性,并利用GraphPadprism8.0软件,采用“多靶单击数学模型”,绘制细胞存活曲线;3.采用传统的差速离心法进行鼻咽癌细胞中外泌体的提取,并通过透射电镜,Western Blot和纳米颗粒追踪分析(NTA)等实验技术鉴定外泌体已经从鼻咽癌各细胞株中成功分离;4.提取鼻咽癌细胞中的外泌体总RNA,利用微量分光光度计检测外泌体总RNA浓度及纯度,最后利用lncRNAs生物芯片分析CNE-1 CRR、CNE-2 CRR外泌体lncRNAs与各自的母细胞株外泌体lncRNAs差异表达谱,筛选出差异表达明显的上调和下调关键外泌体lncRNAs分子。[结论]本实验经过同期放化疗反复处理,已经成功建立CNE-1 CRR、CNE-2 CRR模型。运用lncRNAs生物芯片检测技术,构建了 CNE-1 CRR、CNE-2CRR外泌体lncRNAs与其各自的母细胞株外泌体lncRNAs的差异表达谱。筛选出在CNE-1 CRR、CNE-2 CRR的外泌体中共同存在显著上调的lncRNAs有MALAT1、FAM212B-AS1、LINC-PINT 和 H19,显著下调的 lncRNAs 有 SNHG15、CDKN2B-AS1、ZFAS1、CCAT1、SNHG6、GAPLINC 和 TUG1,以上这些差异表达的外泌体lncRNAs可能在鼻咽癌的放化疗抵抗形成过程中发挥着重要的作用。
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