论文部分内容阅读
研究背景心血管疾病已成为全球死亡率最高的慢性病,心力衰竭（Heart Failure,HF）为各种心血管疾病的最终表现形式且逆转困难,所以改善心力衰竭患者心功能、消除症状、降低恶性心血管事件的发生、提高患者生活质量为心血管医生治疗与努力方向。虽然导致心衰机制并未完全阐明,但目前主流观点认为,心室重构（ventricular remodeling）为心力衰竭发生的病理生理学基础。作为高耗能器官,心室代谢重构（metabolic reprogramming）也就成为心室重构的重要组成部分,而所以心肌细胞代谢调节是心力衰竭能量治疗的热点。过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α）为心肌细胞主要代谢调控辅助因子,既往研究发现心衰时PGC-1α表达下降,但增加表达却未能获益。PGC-1α主要涉及线粒体生物合成,对线粒体氧化呼吸功能起重要作用。因此,我们故提出了如下的科学假设:PGC-1α通过增加线粒体脂肪酸氧化能够改善心衰时心肌细胞能量需求,但长时期激活所产生大量乙酰-COA导致线粒体整体结构蛋白乙酰化水平增加,导致其氧化呼吸功能下降影响心肌收缩功能。本研究通过在新生乳鼠心肌细胞（Neonatal Rat Cardiac Myocytes,NRCMs）中观察PGC-1α对脂肪酸氧化代谢作用的影响,以及长期过表达PGC-1α导致线粒体整体结构蛋白乙酰化水提高而降低其氧化呼吸功能,探究PGC-1α所涉及线粒体蛋白乙酰化水平改变中相关分子信号通路及其调节机制。通过建立小鼠腹主动脉缩窄术后心衰模型,观察过表达PGC-1α对小鼠TAC模型心功能的影响,回顾分析过表达PGC-1α未能获益的影响因素,并探索干预措施的疗效。本研究分三部分进行。第一部分:PGC-1α调控线粒体整体结构蛋白乙酰化水平对NRCMs线粒体氧化呼吸功能的影响目的:探索不同培育时间情况下,NRCMs的PGC-1α表达的改变及其对线粒体功能影响方法:分离NRCMs后培育在脂性培育基中,通过western bolt检测PGC-1α及相关蛋白改变;同时使用PGC-1α激动剂ZLN005和FAO抑制剂MK886后观察脂肪酸代谢通路相关蛋白的改变。通过线粒体膜电位TMRM染色检测线粒体膜电位改变以及使用线粒体氧耗比率（OCR:mitochondrial oxygen consumption rate）检测谢底物糖/脂代谢利用率并分析与PGC-1α相关性。乙酰-motif印迹检测不同浓度乙酰-COA培育、过表达PGC-1α线粒体结构蛋白乙酰化水平。通过WB、RT-PCR检测线粒体乙酰化水平所涉及乙酰化转移酶GCN5L1、去乙酰酶3sirt3的表达。结果:1.NRCMs培育时间增加,PGC-1α表达逐渐增加（P＜0.05）。2.MK886抑制PPAR-α活性的作用,随着MK886浓度的增高,PPAR-α、CPT2、Acadm逐步被抑制（P＜0.05）,ZLN005可激活PGC-1α表达（P＜0.05）,3.TMRM染色提示随着培育时间延长,其线粒体膜电位逐渐增加（P＜0.05）,OCR结果提示随着培育时间延长OCR值由0.80逐渐向0.95靠近。4.乙酰-motif印迹检测结果提示随着乙酰-COA浓度增加线粒体结构蛋白乙酰化水平增加（P＜0.05）,增加PGC-1α可增加线粒体结构蛋白乙酰化水平增加（P＜0.05）,其中增加PGC-1α时Sirt3蛋白表达下降（P＜0.05）,而RT-PCR提示PGC-1α可增加Sirt3mRNA表达（P＜0.05）,GCN5L1表达均无改变,TMRM染色结果提示线粒体结构蛋白乙酰化水平与线粒体膜电位负相关（P＜0.05）。结论:1.NRCMs培育过程中PGC-1α表达增加与其线粒体膜电位、OCR值呈正相关。2.Zln005 可增强 NRCMs 中 PGC-1α-PPARa-FAO 通路的作用,而 MK886 可抑制。3.线粒体结构蛋白可通过非酶促反应与乙酰-COA结合增加线粒体结构蛋白乙酰化水平.4.PGC-1α因激活脂肪酸氧化产生大量乙酰-COA可增加线粒体结构蛋白乙酰化水平。5.增加PGC-1α表达导致Sirt3的蛋白下降可能是由于乙酰化水平增加导致Sirt3消耗增多所致。6.线粒体结构蛋白乙酰化水平增加可降低线粒体膜电位,下调线粒体氧化呼吸功能。第二部分:小鼠TAC心衰模型,心脏组织PGC-1α表达的改变及过表达PGC-1α的影响目的:观察小鼠TAC心衰模型初期和后期心脏组织PGC-1α表达改变,以及过表达PGC-1α的影响。方法:1.建立C57/BL6小鼠主动脉缩窄（transverse aortic constriction,TAC）后心衰模型。2.构建腺病毒Adenovirus-mCherry-PGC-1α及空载腺病毒,3.实验分为:手术组（Con group）、假手术组（sham group）、术后过表达FL-PGC-1α组（FL group）。3.模型建立后4周和12周行超声心动图检测。4.通过WB术检测PGC-1α、心肌组织MHC重链等相关蛋白表达水平。5.处死小鼠后行IHC染色观察心肌组织形态上病理组织改变。结果:超声心动图结果:初期与Con组相比FL组HR增加,LVEF、FS降低而LVSD,LVDD增加,后期:与Con组相比FL组HR增加,LVEF、FS较TAC降低,LVSD、LVDD较TAC组增加（P＜0.05）。2.TTC染色,初期FL组与Con相比室壁厚度变薄,心室腔内径增加;后期:FL组室壁变薄更加明显,心室内径扩张更明显。3.WB结果提示初期:与sham组相比,con组PGC-1α表达增加,FL组PGC-1α表达增加更明显（P＜0.05）;后期:与sham组相比,Con组PGC-1α表达下降,FL组PGC-1α表达增加（P＜0.05）,Con组心肌细胞收缩重链β-MHC表达下降（P＜0.05）,而FL组β-MHC表达进一步下降（P＜0.05）。结论:1.在小鼠TAC心衰模型,初期（向心型肥大时期）心脏组织PGC-1α表达增加,后期（离心型肥大时期）PGC-1α表达下降;2.在小鼠TAC心衰模型中过表PGC-1α可加速左室收缩功能下降,提示在心肌肥厚下增加PGC-1α表达可加速左心室由向心型肥大向离心型肥大发展;3.心脏组织PGC-1α表达与HR呈正相关贯穿整个心衰过程。第三章减慢心率对过表达PGC-1α的心肌细胞和小鼠TAC心衰模型左室重构的影响目的:探索降低收缩节律或减慢心率是否可延缓过表达PGC-1α所致的心肌重构。方法:1.使用笨肾上腺素（Phenylephrine PE）、血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ AngⅡ）培育NRCMs同时使用ZLN00510μg/ML增加PGC-1α表达,在这基础上加用节律控制伊伐布雷定（ivabradine）,同过线粒体膜电位JC-1、乙酰-motif印迹检测线粒体氧化呼吸功能。2.在Con组、FL组基础上加用美托洛尔（Metoprolol）、伊伐布雷定（Ivabradine）,分为:手术加美托洛尔组（C+M group）、手术加伊伐布雷定组（C+I group）、过表达加美托洛尔组（FL+M group）、过表达加伊伐布雷定组（FL+I group）。分别在4周、12周行超声心动图检查及TTC、Masson染色观,WB检测心肌组织PGC-1α、Sirt3、MHC重链表达改变。结果:1.NRCMs培育7天后,PE与AngⅡ刺激下使用zln005降低线粒体膜电位以及增加线粒体结构蛋白乙酰化水平,加入伊伐布雷定可抵抗线粒体膜电位损伤和其乙酰化水平增加。2.超声心动图检测结果提示1.初期:与C+M相比,FL+M 组 HR、LVEF、FS、LVSD、LVDD 未见明显差别（P＞0.05）;与 C+I相比,FL+Ⅰ 组 HR、LVEF、FS、LVSD、LVDD 未见明显差别（P＞0.05）;后期:与C+M相比,FL+M组HR无明显差别,LVEF、FS增加（P＜0.05）、LVSD、LVDD减少（P＜0.05）;与C+I相比,FL+I组HR也无明显差别,LVEF、FS增加（P＜0.05）、LVSD、LVDD 减少（P＜0.05）;3.与 FL 组相比,FL+M、FL+I 心肌细胞收缩蛋白重链β-MHC表达增加（P＜0.05）;4..Masson染色提示心肌纤维化程度,与C+I、C+M组相比,FL+I、FL+M组室壁厚度增加,间质红染率降低（P＜0.05）;与FL组相比,FL+M、FL+I组Sirt3表达增加（P＜0.05）,其中FL+M增加更明显（P＜0.01）;与FL组相比,FL+M、FL+I组线粒体整体结构蛋白乙酰化水平降低（P＜0.05）。结论:1降低NRCMs收缩节律可挽救长期过表达PGC-1α对线粒体氧化呼吸功能的影响。2在小鼠TAC心衰模型中,减慢心率可抵抗过表达PGC-1α所带来不良影响,使用减缓向心型肥大向离心型肥大演进过程,延缓心功能恶化。全文总结1.在NRCMs长期过表达PGC-1α可介导脂肪酸氧化产生大量乙酰-COA通过非酶促反应可增加线粒体结构蛋白乙酰化水平导致线粒体氧化呼吸功能下降。2.在小鼠TAC后心衰模型,过表达PGC-1α可加速向心型肥厚向离心型肥发展,主要原因之一可能为心率增加所致。3.在过表达PGC-1α的小鼠TAC心衰模型,减慢心率可延缓左室向心型肥厚向离心型肥厚进程,延缓心功能恶化。