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温度是决定植物分布和作物产量的主要限制因素。低温胁迫是世界范围内普遍存在的自然灾害,能引起粮食作物和经济作物大幅度减产。了解植物对低温胁迫的耐受机制和提高植物对低温胁迫的忍耐能力是当前科学研究的重要课题。而且随着转基因技术的发展和进步,分子育种成为农作物获得优质、高产、抗性高的植株的手段。虽然分子育种为培育作物优良新品种开辟了一条崭新的快速的方法,但是大量研究表明转基因沉默却成了这种快速育种方法的障碍。天山雪莲是新疆特有的种质资源,为了适应天山极为恶劣的生长环境,其必然要拥有一整套适应极端自然环境的生存机制。如果能从天山雪莲中克隆出能提高植物抗逆性的基因,那对粮食作物和经济作物的增产增值有着重要意义。在此之前,祝建波研究员与其实验室成员运用gateway技术成功地构建了天山雪莲c DNA植物表达文库,并成功地从中克隆出了Sik SACPD,Sik COR,Sik DHN,Sik Trxh,Sik LEA等多个能够提高转基因植物抗逆性的基因。本研究通过结合SMART和均一化技术成功地构建了天山雪莲c DNA文库,并成功地将植物表达文库菌液通过农杆菌介导法直接侵染棉花下胚轴后转入棉花基因组内,通过筛选具有抗寒的棉花愈伤组织,快速有效地获得在转基因棉花植株内能正常表达的天山雪莲抗寒基因。研究中,我们成功地克隆出1个天山雪莲抗寒基因。分析该基因后得出结论,该基因是一个类植物金属硫蛋白基因序列,命名为Sik MT2。生物信息学分析表明,该基因包含一个完整开放阅读框(228bp),编码75个氨基酸。Sik MT2分子量为7.47k Da,理论等电点是4.44,是一个不具有信号肽的亲水性蛋白。氨基酸多序列比对发现Sik MT2序列在N端和C端保守性较高,具有的MT2的典型特征21个物种间的系统发育树表明其与蒲公英进化关系最近。方法:以低温胁迫处理过的天山雪莲组培苗为材料,提取其RNA;运用SMART技术和均一化技术构建天山雪莲c DNA文库;通过农杆菌介导法转化棉花下胚轴,获得转基因棉花愈伤;在半致死温度下处理转基因棉花愈伤;筛选有抗寒性的棉花愈伤并从中克隆出天山雪莲抗寒性基因;通过生物信息学和实时荧光定量分析,预测天山雪莲Sik MT2基因的功能。结果:(1)运用SMART技术和均一化技术成功构建了天山雪莲c DNA文库,经检测天山雪莲c DNA文库的库容量达到了4.26×105cfu,插入片段主要集中在500bp到2000bp之间。(2)通过结合电导法与Logistic方程测得棉花愈伤的半致死温度为-9.947℃。(3)通过农杆菌介导法将天山雪莲c DNA文库侵染棉花下胚轴,获得转基因棉花愈伤。(4)利用棉花愈伤半致死温度处理转基因棉花愈伤组织,获得有抗寒性的棉花愈伤组织。(5)从用抗寒性的棉花愈伤组织中克隆出Sik MT2基因,通过对Sik MT2基因的分析预测该基因编码的蛋白质参与了植物抗氧化作用。(6)通过实时荧光定量PCR(q PCR)检测Sik MT2的表达量发现,Sik MT2受到非生物胁迫的诱导。结论:通过利用棉花半致死温度处理转基因棉花愈伤组织,可以筛选出抗冻的转基因棉花愈伤组织并可以从中克隆具有抗寒性的天山雪莲基因。