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周围动脉疾病(Periphery Artery Disease,PAD)是一组表现为外周动脉狭窄、闭塞的疾病,以下肢发病最为常见。目前对于PAD的治疗方法主要有药物治疗、外科手术治疗等。研究认为以上治疗方式在增加行走时间及距离,减少截肢率及降低死亡率等方面的效果并不理想。治疗性血管生成是治疗PAD一种手段,是以血管生长因子的基因、蛋白或内皮祖细胞等进行局部或系统干预以促进缺血组织血管生成,从而改善外周循环的方法。血管生成是指从已存在的微血管床上芽生出新的,以毛细血管为主的血管系统的过程,主要包括:细胞外基质的降解;血管内皮细胞的激活、增殖、迁移;管腔结构的形成及血管网的重塑。存活素(Survivin,SVV)基因是一种广泛表达于胚胎和肿瘤组织的多效性基因,SVV通过调节肿瘤细胞的凋亡、周期转换、侵袭性等信号通路促进肿瘤的生长、转移及血管生成。目前SVV基因促进肿瘤血管生成的研究已较深入,但关于SVV基因促进正常组织或细胞血管生成的研究甚少,实验采用腺病毒(Adenovirus,Ad)携带SVV基因转染大鼠主动脉内皮细胞(Rat Aortic Endothelial Cell,RAECs)的方式,观察SVV基因对RAECs增殖、迁移、抗凋亡及血管生成的影响,以期于将SVV基因做为新的PAD治疗的血管生成因子。第一部分腺病毒介导大鼠主动脉内皮细胞存活素基因的转染及鉴定目的:鉴定腺病毒介导SVV基因转染RAECs后细胞内SVV基因及蛋白的表达情况。方法:根据对RAECs不同的处理将其分为3组:SVV转染组(Ad-GFP/SVV):RAECs转染携带有SVV基因及GFP的腺病毒;阴性对照组(Ad-GFP):RAECs转染仅携带有GFP的腺病毒;空白对照组(RAEC):RAECs正常培养不做任何处理。用Ad-GFP/SVV组行最佳MOI的鉴定,分别用MOI等于0、10、20、50、100的携带有GFP及SVV基因的腺病毒与RAECs共培养,于12h、24h、48h、72h采用流式细胞仪计算感染率,确定最佳MOI和最佳感染时间后用q RT-PCR及Western blot检测各组RAECs内SVV的m RNA及蛋白的表达情况。结果:转染48h后MOI=50的感染率为(95.67±2.16)%,MOI=100的转染率为(94.53±1.76)%,组间差异无统计学意义(P>0.05);q RT-PCR结果显示SVV转染组m RNA相对表达量显著上调,Western blot结果显示与q RT-PCR结果一致,SVV转染组与空白对照组及阴性对照组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:以MOI=50时携带SVV基因的腺病毒转染RAECs 48h可显著提高其SVV基因和蛋白的表达。第二部分存活素基因对大鼠主动脉内皮细胞增殖的影响目的:研究SVV基因对RAECs增殖的影响。方法:根据对RAECs不同的处理将其分为3组:SVV转染组(Ad-GFP/SVV):RAECs转染携带有SVV基因及GFP的腺病毒;阴性对照组(Ad-GFP):RAECs转染仅携带有GFP的腺病毒;空白对照组(RAEC):RAECs正常培养不做任何处理。按已确定的感染复数和感染时间用各组腺病毒转染RAECs,细胞免疫荧光法检测PCNA表达,MTT法检测RAECs的增殖活性,Western blot法检细胞周期蛋白的表达。结果:SVV转染组的PCNA阳性相对表达量为(85.35±4.93)%;阴性对照组为(51.04±6.86)%;空白对照组为(52.57±5.24)%。MTT法中转染后第1天SVV转染组的OD值为0.93±0.06;阴性对照组为0.77±0.09;空白对照组为0.71±0.14;转染后第2天SVV转染组的OD值为1.28±0.12;阴性对照组为0.91±0.05;空白对照组为0.87±0.06。SVV转染组的PCNA表达量及MTT的OD值显著高于阴性对照组及空白对照组,组间差异具有统计学意义(P<0.05);SVV转染组的周期蛋白cyclin B1、cyclin D1、cyclin E、CDC2、CDK 4、CDK2表达明显上调,与空白对照组及阴性对照组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:SVV基因通过上调RAECs周期蛋白的表达促进RAECs的增殖。第三部分存活素基因对大鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响目的:研究SVV基因对RAECs凋亡的影响。方法:根据对RAECs不同的处理将其分为4组:SVV转染组(Ad-GFP/SVV):RAECs转染携带有SVV基因及GFP的腺病毒后缺氧条件下培养12h;阴性对照组(Ad-GFP):RAECs转染仅携带有GFP的腺病毒缺氧条件下培养12h;缺氧对照组(Control):RAECs不行转染缺氧条件下培养12h;空白对照组(RAEC):RAECs不行转染常氧下培养12h。细胞转染后于缺氧条件下诱导细胞凋亡,采用鬼笔环肽荧光染色法标记微丝(F-actin)的表达情况,TUNEL绿色FITC标记荧光检测法及流式细胞仪检测细胞凋亡的数量,Western blot检RAECs内凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3,8,9的表达。结果:各组细胞经低氧诱导凋亡后,光镜下SVV转染组与RAEC组的RAECs形态良好,细胞间联系紧密,荧光显微镜下阴性对照组、缺氧对照组出现核固缩、核碎裂等典型的凋亡变化;SVV转染组F-actin平行均匀分布于细胞中,与正常RAECs相似,在阴性对照组和缺氧对照组,F-actin降解增加,呈环形富集于细胞膜的周边;流式细胞仪分析结果示SVV转染组细胞凋亡率显著降低,与阴性对照组、缺氧对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果示SVV转染组RAECs的cleaved-Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9的表达减少,与阴性对照组、缺氧对照组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:SVV基因通过下调Caspase-3、8、9的表达抑制低氧诱导的RAECs凋亡。第四部分存活素基因对大鼠主动脉内皮细胞迁移与侵袭的影响目的:研究SVV基因对RAECs迁移与侵袭的影响。方法:根据对RAECs不同的处理将其分为3组:SVV转染组(Ad-GFP/SVV):RAECs转染携带有SVV基因及GFP的腺病毒;阴性对照组(Ad-GFP):RAECs转染仅携带有GFP的腺病毒;空白对照组(RAEC):RAECs正常培养不做任何处理。细胞转染后采用划痕实验,Transwell实验、基质胶小室实验等评估RAECs的迁移能力,使用Western blot检测细胞内MMPs的表达水平。结果:SVV转染组在6,12,24h迁移距离均较阴性对照组和空白对照组迁移距离显著增加(P<0.05);Transwell实验中,SVV转染组穿过聚碳酸酯膜的RAECs较阴性对照组和空白对照组显著增加(P<0.05);Western blot结果示SVV转染组RAECs内MMP-2、7、8、9的表达水平均高于阴性转染组和空白对照组。结论:SVV通过上调MMP-2、7、8、9的表达增加RAECs迁移和侵袭能力。第五部分存活素基因对大鼠主动脉内皮细胞小管形成及血管生成的影响目的:观察SVV基因对RAECs在体外管腔形成及体内血管生成的影响。方法:根据对RAECs不同的处理将其分为3组:SVV转染组(Ad-GFP/SVV):RAECs转染携带有SVV基因及GFP的腺病毒;阴性对照组(Ad-GFP):RAECs转染仅携带有GFP的腺病毒;空白对照组(RAEC):RAECs正常培养不做任何处理。SVV基因转染后,将RAECs接种在Martigel基质胶预处理的48孔板中,观察管腔形成的情况,并用ELISA检测细胞培养基上清液中血管内皮生长因子(VEGF)的表达;将转染后的细胞与Martigel基质胶混合液接种至裸鼠皮下,7天后采用HE染色、Masson染色及CD31免疫组化染色评估裸鼠皮下血管生成的情况。结果:SVV转染组相对于正常对照组的小管与分支的比例显著高于阴性对照组(P<0.05)。ELISA检测结果示SVV转染组VEGF表达量显著增加,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。在体实验中,SVV转染组可明显见到横行整齐排列的毛细血管,经量化统计分析SVV转染组被膜与胶栓内血管数均显著高于阴性对照组和正常对照组(P<0.05)。结论:SVV基因使RAECs在基质胶中直接参与管腔形成。SVV基因提高RAECs移植周围组织中VEGF的表达水平,促进血管的生成。