论文部分内容阅读
目的：急性肺功能损伤简称ALI（Actue lung injure）是一种发病机制复杂，死亡率、发病率均较高的疾病，多形核中性粒细胞(polymorphonuclear,PMN)的凋亡延迟与炎症因子网络启动的激活是急性肺损伤产生的关键机制之一。TLR4/NF-κB信号通路可能也参与了ALI的发生发展过程。白藜芦醇具有较强的抗炎作用，本研究通过复制脂多糖(LPS)致急性肺损伤(ALI)动物模型，探索白藜芦醇对脂多糖致急性肺损伤动物模型是否具有保护作用，且中性粒细胞的凋亡、TLR4/NF-κB信号通路关键因子以及炎症因子与抗炎因子间的平衡跟其作用间有无关系。
方法：将48只昆明种小鼠分为六组：阴性对照组、阳性对照组、模型组、白藜芦醇100mg/kg组、白藜芦醇200mg/kg组、白藜芦醇400mg/kg组，共6组，每组8只。鼻内滴注脂多糖5.0mg/kg建立急性肺损伤模型。阴性对照组不作处理，阳性对照组给予地塞米松2.5mg/kg，白藜芦醇各组给予100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg灌胃给药，造模前连续给药7天，每天一次。造模24小时后处死动物，取支气管灌注液(BALF)检测白细胞百分比。用Hochest33342对BALF进行染色，在荧光显微镜下检测BALF中多形核中性粒细胞的凋亡情况。用流式细胞仪测量BALF中多形核中性粒细胞的凋亡率。取肺组织测肺湿重/干重比值。用HE染色法通过光镜观察所取动物肺标本的病理改变情况。之后为了分析白藜芦醇作用机制，鼻内滴注脂多糖5.0mg/kg建立急性肺损伤模型。阴性对照组不作处理，TAK242组给予腹腔注射TAK-242溶液(3mg/kg)，每天1次，连续3天，白藜芦醇各组提前7天分别按100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg灌胃给药。造模24小时后处死动物，取肺组织采用免疫印迹法测TLR4，COX-2，NF-κB蛋白表达，采用ELISA法检测血浆IL-6，TNF-α，IL-10表达。
结果：(1)白藜芦醇对ALI小鼠BALF白细胞百分比影响：阴性对照组ALI小鼠支气管灌注液中白细胞数量较少，模型组BALF白细胞数量增加显著。将模型组与阴性对照组的实验结果进行比较，存在明显差异(P＜0.01)。将阳性对照组、白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组与模型组比较，灌注液中白细胞数量均比模型组低，比较有统计学意义(P＜0.05)。(2)白藜芦醇对ALI小鼠BALF中性粒细胞凋亡影响：荧光结果显示，阴性对照组正常中性粒细胞较多，呈浅蓝色，亮蓝色凋亡细胞较少，模型组中性粒细胞呈亮蓝色较多，提示凋亡细胞明显增加。阳性对照组、白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg亮蓝色细胞多于模型组，浅蓝色细胞少于模型组。阴性对照组正常中性粒细胞凋亡率较低为0.07％，模型组凋亡率为0.75％，同阴性对照组比较有统计学意义(P＜0.01)。同模型组比较，阳性对照组、白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组明显促进中性粒细胞凋亡率，比较有统计学意义(P＜0.01)。(3)白藜芦醇对ALI小鼠肺湿重/干重比值影响：将模型组的肺湿重/干重比值与阴性对照组的肺湿重/干重比值进行比较，模型组比值明显较高，有统计学意义(P＜0.01)，与模型组比较，阳性对照组、白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组，肺湿重/干重比值明显降低，比较有统计学意义(P＜0.01)。(4)白藜芦醇对ALI小鼠肺组织病理改变影响：在阴性对照组中观察到了结构完整、肺泡腔干净的肺组织，也未见肺部结构的其他病理改变。模型组镜下观察发现肺组织呈暗红色，观察到局部有出血和少量液体渗出，出现组织水肿、血管及黏膜充血，肺组织变大，部分肺叶可观察到红色，已发生肺部组织的实质性病变，还可见肺泡壁增宽等急性炎症表现。通过以上实验观察，脂多糖诱导急性肺损伤模型有效且成功。白藜芦醇100mg/kg组通过镜下观察肺组织表面可见散在的出血点，部分组织可见充血，与模型组对比症状较轻，范围更小。阳性对照、白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组肺表出血点较少，水肿症状较轻，渗出程度较模型组轻。(5)白藜芦醇对ALI小鼠肺TLR4，COX-2，NF-κB等蛋白表达影响：阴性对照组TLR4，COX-2，NF-κB蛋白表达较少，模型组TLR4，COX-2，NF-κB蛋白的表达较多，同阴性对照组比较，模型组灰度值更高，两者之间差异显著(P＜0.01)。将TAK-242组、模型组，白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组蛋白的表达和灰度值与模型组进行比较，均较模型组降低，与模型组比较差异显著，有统计学意义(P＜0.05)。(6)白藜芦醇对ALI小鼠血浆IL-6,TNF-α,IL-10浓度影响：阴性对照细匝-6，TNF-α，IL-10浓度较低，模型组IL-6，TNF-α明显上升，IL-10表达较阴性对照组高，与阴性对照组比较有统计学意义(P＜0.01)。同模型组比较，TAK-242组、模型组，白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组IL-6，TNF-α下降，IL-10表达增高，比较有统计学意义(P＜0.05)。
结论：(1)：白藜芦醇对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)模型小鼠有保护作用。(2)白藜芦醇保护机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路，促进中性粒细胞凋亡和减少炎症因子释放，调整炎症因子平衡有关。
方法：将48只昆明种小鼠分为六组：阴性对照组、阳性对照组、模型组、白藜芦醇100mg/kg组、白藜芦醇200mg/kg组、白藜芦醇400mg/kg组，共6组，每组8只。鼻内滴注脂多糖5.0mg/kg建立急性肺损伤模型。阴性对照组不作处理，阳性对照组给予地塞米松2.5mg/kg，白藜芦醇各组给予100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg灌胃给药，造模前连续给药7天，每天一次。造模24小时后处死动物，取支气管灌注液(BALF)检测白细胞百分比。用Hochest33342对BALF进行染色，在荧光显微镜下检测BALF中多形核中性粒细胞的凋亡情况。用流式细胞仪测量BALF中多形核中性粒细胞的凋亡率。取肺组织测肺湿重/干重比值。用HE染色法通过光镜观察所取动物肺标本的病理改变情况。之后为了分析白藜芦醇作用机制，鼻内滴注脂多糖5.0mg/kg建立急性肺损伤模型。阴性对照组不作处理，TAK242组给予腹腔注射TAK-242溶液(3mg/kg)，每天1次，连续3天，白藜芦醇各组提前7天分别按100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg灌胃给药。造模24小时后处死动物，取肺组织采用免疫印迹法测TLR4，COX-2，NF-κB蛋白表达，采用ELISA法检测血浆IL-6，TNF-α，IL-10表达。
结果：(1)白藜芦醇对ALI小鼠BALF白细胞百分比影响：阴性对照组ALI小鼠支气管灌注液中白细胞数量较少，模型组BALF白细胞数量增加显著。将模型组与阴性对照组的实验结果进行比较，存在明显差异(P＜0.01)。将阳性对照组、白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组与模型组比较，灌注液中白细胞数量均比模型组低，比较有统计学意义(P＜0.05)。(2)白藜芦醇对ALI小鼠BALF中性粒细胞凋亡影响：荧光结果显示，阴性对照组正常中性粒细胞较多，呈浅蓝色，亮蓝色凋亡细胞较少，模型组中性粒细胞呈亮蓝色较多，提示凋亡细胞明显增加。阳性对照组、白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg亮蓝色细胞多于模型组，浅蓝色细胞少于模型组。阴性对照组正常中性粒细胞凋亡率较低为0.07％，模型组凋亡率为0.75％，同阴性对照组比较有统计学意义(P＜0.01)。同模型组比较，阳性对照组、白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组明显促进中性粒细胞凋亡率，比较有统计学意义(P＜0.01)。(3)白藜芦醇对ALI小鼠肺湿重/干重比值影响：将模型组的肺湿重/干重比值与阴性对照组的肺湿重/干重比值进行比较，模型组比值明显较高，有统计学意义(P＜0.01)，与模型组比较，阳性对照组、白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组，肺湿重/干重比值明显降低，比较有统计学意义(P＜0.01)。(4)白藜芦醇对ALI小鼠肺组织病理改变影响：在阴性对照组中观察到了结构完整、肺泡腔干净的肺组织，也未见肺部结构的其他病理改变。模型组镜下观察发现肺组织呈暗红色，观察到局部有出血和少量液体渗出，出现组织水肿、血管及黏膜充血，肺组织变大，部分肺叶可观察到红色，已发生肺部组织的实质性病变，还可见肺泡壁增宽等急性炎症表现。通过以上实验观察，脂多糖诱导急性肺损伤模型有效且成功。白藜芦醇100mg/kg组通过镜下观察肺组织表面可见散在的出血点，部分组织可见充血，与模型组对比症状较轻，范围更小。阳性对照、白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组肺表出血点较少，水肿症状较轻，渗出程度较模型组轻。(5)白藜芦醇对ALI小鼠肺TLR4，COX-2，NF-κB等蛋白表达影响：阴性对照组TLR4，COX-2，NF-κB蛋白表达较少，模型组TLR4，COX-2，NF-κB蛋白的表达较多，同阴性对照组比较，模型组灰度值更高，两者之间差异显著(P＜0.01)。将TAK-242组、模型组，白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组蛋白的表达和灰度值与模型组进行比较，均较模型组降低，与模型组比较差异显著，有统计学意义(P＜0.05)。(6)白藜芦醇对ALI小鼠血浆IL-6,TNF-α,IL-10浓度影响：阴性对照细匝-6，TNF-α，IL-10浓度较低，模型组IL-6，TNF-α明显上升，IL-10表达较阴性对照组高，与阴性对照组比较有统计学意义(P＜0.01)。同模型组比较，TAK-242组、模型组，白藜芦醇100mg/kg组，白藜芦醇200mg/kg组，白藜芦醇400mg/kg组IL-6，TNF-α下降，IL-10表达增高，比较有统计学意义(P＜0.05)。
结论：(1)：白藜芦醇对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)模型小鼠有保护作用。(2)白藜芦醇保护机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路，促进中性粒细胞凋亡和减少炎症因子释放，调整炎症因子平衡有关。