背景和目的世界范围内,肝癌均是常见的肿瘤之一,具有恶性度高、侵袭性强、进展快、预后差等特点,但是肝癌的成瘤原因尚不清楚。对于肝癌的起源有多种学说,其中最为重要的即肝癌干细胞理论。肝癌干细胞是肝癌细胞中一小群特殊的细胞,同时具备肿瘤细胞特征和干细胞特性,可以激活数个信号通路,具有自我更新和分化潜力,促进肝癌细胞发生发展和转移复发,且对治疗药物耐药。但是肝癌干细胞的自我更新机制仍有待进一步探讨,肝癌干细胞的调控机制亦不清楚。肝癌的治疗包含了肝移植、手术切除、介入治疗、靶向药物、化疗、放疗、免疫治疗等多种治疗手段,但总生存率提高并不显著。目前的治疗措施罕有针对肿瘤干细胞发挥治疗作用,这可能是导致肿瘤复发、转移和耐药的主要原因。结肠腺瘤样息肉病基因(Adenomatous polyposis coli,APC)是 Wnt/β-catenin信号的拮抗剂,APC作为一种抑癌基因家族成员,在肿瘤的发生和Wnt/β-catenin活化中发挥着关键作用。然而APC基因表达如何调控目前并不清楚。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸,不具有编码蛋白质功能的RNA。LncRNA在多个层面上调控基因的表达水平,在肿瘤等多种疾病的发生过程中具有重要作用。多种lncRNAs参与Wnt/β-catenin信号通路的激活,然而,lncRNAs是否参与肝癌细胞APC的表达以及调控Wnt/β-catenin的机制仍不明了。本研究发现了一个长链非编码RNA,定位在APC基因附近,命名为LncAPC,我们的研究第一次综合分析了 LncAPC在肝癌细胞和肝癌干细胞的表达,探讨了 LncAPC对肝癌干细胞的影响,进一步研究了其对信号通路的影响和调节肿瘤作用的分子机制,为靶向肝癌干细胞治疗提供了新的靶标。本研究分为五部分,第一部分:LncRNA的筛选及表达研究。第二部分:LncAPC的功能研究。第三部分:LncAPC对Wnt/β-catenin信号通路的影响。第四部分:LncAPC发挥功能的分子机制研究。第五部分:LncAPC-EZH2-APC可以作为肝癌干细胞治疗的靶标。第一部分LncRNA的筛选及表达研究方法:1.蛋白质印迹(Westernblotting)检测APC蛋白在癌旁组织、早期及晚期肝癌组织表达水平,流式细胞术(FACS)分选出CD133+肝癌干细胞及CD133-肝癌干细胞,实时定量(Realtime quantitative)PCR检测APC表达水平,Western blotting检测成球和非成球细胞APC表达水平。2.运用UCSC网站筛选APC在染色体的位置及附近的lncRNAs。3.反义寡核苷酸(ASO)敲低lncRNAs的表达,RealtimeqPCR检测敲低效果和APC的表达水平,确定我们关注的lncRNA。4.RealtimeqPCR检测癌旁组织、早期和晚期肝癌组织中LncAPC的表达,并通过原位杂交(ISH)实验进一步检测LncAPC在癌旁组织、早期和晚期肝癌组织中的表达。5.FACS分选出CD133+及CD133-肝癌干细胞、小球形成实验收集小球和非小球两种方法富集肝癌干细胞,Realtime qPCR检测LncAPC表达水平。6.荧光原位杂交(FISH)检测LncAPC在小球和非小球的表达。结果:1.Western blotting结果显示APC在晚期肝癌组织的表达水平低于早期肝癌组织及癌旁组织,FACS和Realtime qPCR结果显示APC在肝癌干细胞中的表达水平低于非干细胞(P<0.05),成球实验结果显示成球细胞较非成球细胞APC蛋白表达低。2.UCSC网站中筛选,发现在APC附近有5条lncRNAs。3.ASO敲低lncRNAs的表达后,肝癌细胞和肝癌样本中lncRNAs表达均有下降(P<0.05),Realtime qPCR检测APC的表达水平,结果显示lnc1敲低的细胞APC表达较对照组升高(P<0.05),lnc2-lnc5敲低的细胞APC表达变化不大。因此,我们关注lnc1并将其命名为LncAPC。4.RealtimeqPCR检测癌旁组织、早期和晚期肝癌组织中LncAPC的表达,结果显示晚期肝癌组织中LncAPC高表达细胞比例和光子强度均高于早期肝癌组织及癌旁组织(P<0.05)。原位杂交结果进一步验证了上述结果,且LncAPC主要定位在细胞核内。LncAPC和APC的表达水平呈负相关。5.FACS分选富集CD133+肝癌干细胞,Realtime qPCR检测LncAPC的表达,结果提示LncAPC在CD133+肝癌干细胞中表达较CD133-非干细胞中表达高(P<0.05)。LncAPC在成球细胞中表达水平较非成球细胞高。6.荧光原位杂交检测LncAPC在小球和非小球的表达量,结果显示LncAPC在小球中高表达,且主要分布在细胞核内。第二部分LncAPC功能研究方法:1.ASO方法建立LncAPC敲低的细胞系,Northern blotting检测LncAPC的表达,用LncAPC敲低的细胞做成球实验,检测成球能力。2.LncAPC敲低的细胞做成球实验,继续行连续四代成球实验,检测LncAPC敲低细胞的持续成球能力。3.LncAPC沉默的细胞种植到BALB/c裸鼠,异种移植肿瘤生长实验检测LncAPC敲低的细胞成瘤后的肿瘤重量。4.给BALB/c裸鼠分别种植不同数目LncAPC敲低的肝癌细胞,梯度稀释移植瘤实验检测无肿瘤小鼠的比例。5.慢病毒载体构建LncAPC高表达的细胞,进一步做LncAPC高表达细胞和对照细胞的成球实验,检测成球能力。6.LncAPC高表达的细胞和对照细胞种植到BALB/c裸鼠,异种移植肿瘤生长实验检测LncAPC高表达的细胞成瘤后的肿瘤重量。7.给BALB/c裸鼠分别种植不同数目LncAPC高表达的肝癌细胞和对照细胞,梯度稀释移植瘤实验检测无肿瘤小鼠的比例。结果:1.ASO方法建立了LncAPC敲低的细胞系,Northernblotting检测LncAPC的表达较敲低前下降,用LncAPC敲低的细胞和对照细胞做成球实验,结果显示LncAPC敲低的细胞,肿瘤起始细胞比例较对照组降低,成球能力下降,差异有统计学意义(P<0.05)。2.LncAPC敲低的细胞做成球实验,形成的小球消化成单细胞,继续做成球实验,经过连续4代成球能力的评估,结果显示敲低LncAPC表达后,连续4代成球起始细胞比例均较对照组降低,差异有显著性(P<0.05)。3.LncAPC沉默的细胞和对照细胞种植到BALB/c裸鼠,检测LncAPC敲低的细胞成瘤后的肿瘤重量,结果显示LncAPC敲低的细胞成瘤后的肿瘤重量较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.给BALB/c裸鼠分别种植不同数目LncAPC敲低的肝癌细胞和对照细胞,梯度稀释移植瘤实验检测肿瘤形成的比例,结果显示无肿瘤小鼠的比例随种植细胞数目增加逐步减少,LncAPC敲低的细胞种植组的无肿瘤小鼠比例较对照组高,差异有统计学意义(P<0.05)。5.慢病毒载体构建了LncAPC高表达的细胞,进一步做LncAPC高表达细胞和对照细胞的成球实验,结果显示LncAPC高表达的细胞,成球能力增强,差异有显著性(P<0.05)。6.LncAPC高表达的细胞和对照细胞种植到BALB/c裸鼠,检测LncAPC高表达的细胞成瘤后的肿瘤重量,结果显示LncAPC高表达的细胞成瘤后的肿瘤重量较对照组高,差异有统计学意义(P<0.05)。7.给BALB/c裸鼠分别种植不同数目LncAPC高表达的肝癌细胞和对照细胞,梯度稀释移植瘤实验检测肿瘤形成的比例,结果显示无肿瘤小鼠的比例随种植细胞数目增加逐步减少,LncAPC高表达的细胞种植组的无肿瘤小鼠比例较对照组低,差异有显著性(P<0.05)。第三部分LncAPC对Wnt/β-catenin信号通路的影响方法:1.LncAPC敲低和高表达的肝癌细胞,分别检测了NF-κB,Wnt/β-catenin,Notch和Hedgehog四个主要信号转导通路的靶基因表达并以热图显示。2.LncAPC敲低的细胞和对照细胞,TOPFlash荧光素酶报告基因实验检测Wnt/β-catenin信号通路的活化能力。3.Western blotting检测LncAPC敲低和高表达细胞的β-catenin核内表达情况。4.CRISPR/Cas9方法建立APC敲除的细胞系,Western blotting检测APC敲除效果及Wnt/β-catenin信号通路经典的靶基因Axin2表达情况。5.在APC敲除的肝癌细胞中,Realtime qPCR方法检测LncAPC的表达水平。6.在APC敲除的肝癌细胞中,进一步敲低或高表达LncAPC,检测主要信号通路靶基因的表达。结果:1.LncAPC敲低和高表达的肝癌细胞,检测四个主要信号转导通路的靶基因表达水平,热图显示Lnc APC沉默的细胞中Wnt/β-catenin靶基因表达下调,LncAPC高表达的细胞中Wnt/β-catenin靶基因表达升高。2.LncAPC敲低的细胞和对照细胞,TOPFlash荧光素酶报告基因实验结果发现与对照细胞相比,ASO敲低LncAPC表达之后,Wnt/β-catenin信号通路的激活受损(P<0.05)。3.Western blotting检测LncAPC敲低和高表达的细胞中β-catenin核内表达情况,结果显示LncAPC敲低的细胞中核内β-catenin减少,LncAPC高表达的细胞中核内β-catenin增加。4.CRISPR/Cas9方法建立了 APC敲除细胞系,Western blotting结果发现APC确实有敲除,且APC敲除之后Wnt/β-catenin信号通路经典的靶基因Axin2表达量升高。5.在APC敲除的细胞中,Realtime qPCR检测LncAPC的表达水平,结果显示APC基因敲除对LncAPC的表达无影响(P>0.05)。6.在APC敲除的肝癌细胞中,进一步敲低或高表达LncAPC,检测主要信号通路靶基因的表达量,发现APC敲除之后,敲低和高表达LncAPC对Wnt/β-catenin信号通路的靶基因活性无影响。第四部分LncAPC发挥功能的分子机制研究方法:1.RNA下拉(RNA pulldown)实验确定LncAPC作用蛋白,质谱分析鉴定LncAPC作用蛋白。2.对癌旁组织、肝癌组织及肝癌细胞行Realtime qPCR及Western blotting检测EZH2蛋白的表达。成球及非成球肝癌细胞Western blotting检测EZH2蛋白表达情况。3.RNA pulldown之后,做Western blotting,用EZH2抗体检测进一步验证EZH2和LncAPC之间的相互作用。构建LncAPC的截短体,用不同的截短体做 RNA pulldown,Western blotting 及 EZH2 抗体检测,确定 LncAPC 的哪一段和EZH2相互作用。4.LncAPC第二段作探针,电泳泳动迁移实验(EMSA)进一步验证EZH2和LncAPC之间的相互作用。5.EZH2的抗体和IgG对照抗体做RNA免疫沉淀实验(RIP),Realtime qPCR方法检测LncAPC的富集情况,进一步从体内验证LncAPC和EZH2的相互作用。6.双荧光原位杂交(Double FISH)染色,进一步验证LncAPC和EZH2的相互作用。7.ASO敲低LncAPC的表达和抑制剂抑制EZH2的活性,Western blotting和Realtime qPCR检测LncAPC敲低和EZH2抑制的细胞中,APC的表达和Wnt/β-catenin信号通路的活化情况。8.EZH2抗体和LncAPC探针做染色质免疫共沉淀(ChIP)和RNA纯化染色质分离技术(ChIRP),Realtime qPCR检测APC启动子的富集情况。9.LncAPC敲低的细胞和对照细胞,做EZH2的CHIP实验,Realtime qPCR检测APC启动子的富集情况,检测LncAPC的表达与EZH2-APC启动子结合强度的相关性。10.LncAPC 敲低的细胞和对照细胞,做 H3K9Me3,H4K20Me3、H3K27Me3三种抑制性组蛋白修饰的ChIP实验,Realtime qPCR检测APC启动子富集情况,Western blotting检测三种抑制性组蛋白修饰的总体修饰强度。11.LncAPC高表达的细胞和对照细胞,做抑制性组蛋白修饰抗体H3K27me3的ChIP实验,Realtime qPCR检测APC启动子的富集情况,用LncAPC敲低和高表达的细胞,做活化性组蛋白修饰抗体H3K27Ac和H3K4me3的ChIP实验,Realtime qPCR检测APC启动子的富集情况。12.EZH2抑制的细胞和对照细胞做三种抑制性组蛋白修饰的ChIP实验,Realtime qPCR检测APC启动子的富集情况,Western blotting检测三种抑制性组蛋白修饰的总体修饰强度。13.肝癌样本做三种抑制性组蛋白修饰的ChIP实验,Realtime qPCR检测APC启动子富集情况,探讨LncAPC的表达与三种APC启动子抑制性组蛋白修饰的相关性。结果:1.通过RNA pulldown实验确定了 LncAPC作用蛋白,质谱分析鉴定LncAPC作用蛋白为EZH2。2.对癌旁组织、肝癌组织及肝癌细胞行Realtime qPCR检测,结果发现,EZH2在肝癌组织和细胞系Huh7和Hep3B中高表达。Western blotting检测癌旁组织、早期肝癌和晚期肝癌的EZH2蛋白水平,结果显示EZH2表达量随着肿瘤的进展逐步升高。成球及非成球肝癌细胞收集后进一步行Western blotting检测EZH2表达,结果显示成球肝癌细胞EZH2表达量较非成球细胞高。3.在RNA pulldown之后,做Western blotting,EZH2抗体检测,发现LncAPC确实能够下拉EZH2,证实了EZH2和LncAPC之间的相互作用。我们构建了LncAPC的截短体,用不同的截短体做RNA pulldown,Western blotting及EZH2抗体检测,结果发现LncAPC的第二段和EZH2相互作用。4.LncAPC第二段作探针,EMSA实验结果显示有电泳迁移,进一步证明了EZH2和LncAPC之间的相互作用。5.EZH2的抗体和IgG对照抗体做RIP实验,Realtime qPCR方法检测LncAPC的富集,发现能够明显富集到LncAPC,进一步从体内证明LncAPC和EZH2的相互作用(P<0.05)。6.对成球实验形成的小球行Double FISH染色,进一步证明了 LncAPC和EZH2的相互作用,且LncAPC和EZH2有明显的共定位。7.Western blotting和Realtime qPCR检测LncAPC敲低的细胞和EZH2抑制的细胞中,APC的表达和Wnt/β-catenin信号通路的活化情况,结果显示LncAPC敲低和EZH2抑制均可使APC的表达量升高(P<0.05),Wnt/β-catenin信号通路受到抑制。8.EZH2抗体做ChIP,Realtime qPCR检测APC启动子的富集情况,发现EZH2能够结合APC的启动子(P<0.05);同样,用LncAPC做CHIRP,Realtime qPCR检测APC启动子的富集情况,也能检测到LncAPC和APC启动子的结合(P<0.05)。并且,EZH2和LncAPC结合到APC启动子的同一区域。9.LncAPC敲低的细胞和对照细胞,检测EZH2结合APC启动子的能力,发现LncAPC敲低之后,EZH2和APC启动子的结合明显受到抑制,证实LncAPC能够招募EZH2到APC的启动子区域(P<0.05)。对肝癌样本进行EZH2的CHIP实验,Realtime qPCR检测APC驱动子的富集情况,结果显示LncAPC的表达量与EZH2-APC启动子的结合强度存在正相关。10.LncAPC敲低的细胞和对照细胞,做H3K9Me3,H4K20Me3、H3K27Me3三种抑制性组蛋白修饰的ChIP实验,Realtime qPCR检测APC启动子富集情况,结果发现LncAPC敲低的细胞中,抑制性修饰减少,表明转录活化(P<0.05)。进一步行Western blotting检测细胞总体的抑制性修饰强度,结果显示没有变化。11.LncAPC高表达的细胞和对照细胞,做抑制性组蛋白修饰抗体H3K27me3的ChIP实验,Realtime qPCR检测APC启动子的富集情况,结果显示LncAPC高表达的细胞中APC启动子富集增多(P<0.05)。用LncAPC敲低和高表达的细胞,做活化性组蛋白修饰抗体H3K27Ac和H3K4me3的ChIP实验,Realtime qPCR检测APC启动子的富集情况,结果显示LncAPC敲低后,APC启动子的富集增多(P<0.05);LncAPC高表达后,APC启动子的富集减少(P<0.05)。12.用EZH2抑制的细胞和对照细胞做H3K9Me3,H4K20Me3、H3K27Me3三种抑制性组蛋白修饰的ChIP实验,Realtime qPCR检测APC启动子的富集情况,结果显示EZH2抑制的细胞中,抑制性修饰减少(P<0.05),Western blotting检测H3K9me3和H4K20me3两种抑制性组蛋白修饰的总体修饰强度无变化,H3K27Me3修饰强度下降。13.对肝癌样本进行H3K9Me3,H4K20Me3、H3K27Me3三种抑制性组蛋白修饰的ChIP实验,Realtime qPCR检测APC启动子富集情况,结果显示LncAPC的表达与APC启动子的富集存在正相关。第五部分LncAPC-EZH2-APC可以作为肝癌干细胞治疗的靶标方法:1.CRISPR/Cas9技术敲除肝癌细胞中的APC,做小球形成实验,进行成球能力的评估。2.用EZH2抑制剂GSK126和GSK343处理的细胞和Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Wiki4,XAV-939处理的细胞,做小球形成实验,进行成球能力的评估。3.用EZH2抑制剂处理的细胞以及Wnt/β-catenin信号通路抑制的细胞,皮下注射至6周龄BALB/c裸鼠,每组六只小鼠,做肿瘤扩增实验,1月后检测形成肿瘤的重量。4.经免疫组化染色后,显示EZH2抑制的细胞和Wnt/β-catenin信号通路抑制的细胞,成瘤后c-Myc的表达量变化情况。5.EZH2抑制剂处理的细胞及Wnt/β-catenin信号通路抑制的细胞成瘤后,FACS检测CD 133+的肝癌干细胞数目。结果:1.CRISPR/Cas9技术敲除肝癌细胞中的APC,做小球形成实验,发现APC敲除能够促进肝癌干细胞的自我更新(P<0.05)。2.用EZH2抑制的细胞和Wnt/β-catenin信号通路抑制的细胞,做小球形成实验,发现处理后的细胞,形成的小球更少,成球能力降低(P<0.05)。3.用EZH2抑制的细胞和Wnt/β-catenin信号通路抑制的细胞,做肿瘤扩增实验,检测形成肿瘤的重量,发现处理之后的细胞,形成的肿瘤也更小(P<0.05)。4.经免疫组化染色后,结果显示EZH2抑制的细胞和Wnt/β-catenin信号通路抑制的细胞,成瘤后c-Myc的表达量有明显减少,同时,EZH2抑制后APC的表达增强,抑制性修饰组蛋白H3K27me3表达下降。5.EZH2抑制的细胞及Wnt/β-catenin信号通路抑制的细胞成瘤后,FACS检测CD133+的肝癌干细胞数目明显减少。结论:1.发现一个非编码RNA,LncAPC,可以促进肝癌干细胞自我更新2.LncAPC抑制APC的表达并激活Wnt/β-catenin信号通路3.LncAPC主要通过募集EZH2到APC启动子区域从而抑制APC转录4.LncAPC-EZH2-APC可以作为清除肝癌干细胞靶点