论文部分内容阅读
聚合酶链式反应(PCR)是一种快速的、便捷的DNA体外扩增方法,可用于细菌检测和鉴定等多个领域。该方法具有操作简单、灵敏度强、检测时间短等优点。本研究将PCR方法应用于快速检测啤酒污染菌。通过培养基检测方法,从啤酒的成品、清酒、发酵液之中分离、纯化获得8种啤腐败酒菌,结合脂肪酸鉴定方法初步判定试验菌,最终通过PCR测序方法获得8株菌株的种属情况,分别是：Lactobacillus plantarum (JSB)、Lactobacillus parabuchneri(白)、Staphylococcus saprophyticus(球)、Lactobacillus brevis BSO 464 (47)、Lactobacillus brevis (49)、Lactobacillus farciminis (50)、Lactobacillus brevis KB290 (58)、Lactobacillus brevis M8 (61)。利用响应面法对一株啤酒腐败菌(Lactobacillus plantarum JSB)的富集培养条件进行优化。采用MRS液体培养,探索其24 h内富集增菌的最优条件。生长因子、摇床转速和初始pH的单因素试验结果显示,这3个因素对乳酸菌的富集起显著作用。采用Box-Behnken试验设计和响应面分析确定了腐败菌富集的最佳条件：摇床转速为153r/min,初始pH为7.57,生长因子添加量为11.8%(体积比)。在此条件下,污染菌24h OD600数值最大,为2.215,比优化前(OD600=0.786)增加182%。参考41株啤酒常见腐败乳酸杆菌的抗酒花基因(HorA、HorC)的序列,设计出三对特异性引物,通过电泳图谱和阴性对照试验证明,这些引物可以特异性地检测分离获得啤酒腐败菌。同时,与啤酒腐败菌通用的16SrDNA引物相结合进行多重PCR,可直接判定是否是腐败乳酸菌,单引物最低检测限达到5cfu/mL。