论文部分内容阅读
SDF-1(stromal-derived factor-1,间质衍生因子),也被称为CXCL12,通过激活G蛋白偶联受体——CXCR4(C-X-C chemokine receptor4,C-X-C型趋化因子受体4),在调节干细胞/前体细胞及淋巴细胞运输、炎症反应、免疫系统的维持、红细胞生成、心脏及血管等器官发生以及组织器官再生等过程中起着重要作用。AMD3100是一种人工合成的小分子大环类SDF-1受体CXCR4特异性拮抗剂,可有效地与CXCR4结合,阻断SDF-1与CXCR4之间的结合以及随后的信号转导,可作为治疗非何杰金氏淋巴瘤(NML)及多发性骨髓瘤(NM)的一种有效的造血干细胞动员剂。研究表明,AMD3100在SDF-1/CXCR4信号通路参与调控的病理过程中发挥重要作用。最近研究表明,SDF-1/CXCR4信号通路在骨生长分化及重塑、钙动员、骨髓成髓作用以及成骨细胞分化过程中起作用,Kitaori等人研究表明SDF-1/CXCR4信号通路在体内骨骼修复过程中参与骨折部位间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的募集;Zhu及Hosogane等人研究表明该通路参与骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2, BMP2)介导的初级MSC或MSC细胞系的成骨分化过程。并且,在多种干细胞以及前体细胞中均有SDF-1和CXCR4的表达,其中骨髓间充质干细胞中二者表达尤为丰富,一旦细胞开始分化二者表达量会显著下降,Kortesidis A等在体外实验中发现SDF-1和CXCR4在前成骨细胞中高度表达,而在成熟的成骨细胞、破骨细胞中含量较低,这表明SDF-1/CXCR4信号通路在成骨分化前期起着重要作用。因此,成骨分化过程中SDF-1/CXCR4信号通路拮抗剂AMD3100的有效性及毒性研究显得尤为必要。到目前为止,有关AMD3100在MSC细胞成骨分化初期发挥作用的研究甚少,尤其是AMD3100对前成骨细胞基质矿化调节的研究尚未见文献报道。另外,SDF-1与CXCR4的结合会激活JAK/STAT通路, JAK(Janus kinase,Janus激酶)被CXCR4激活并与之结合,该结合可促进转录因子STAT3(signaltransducer and activator of transcription3,信号传导子及转录激活子3)的募集和酪氨酸磷酸化,而AMD3100可能通过调节STAT3而在前成骨细胞的成骨分化过程中发挥一定的作用。目的:本研究旨在阐释SDF-1/CXCR4通路在成骨分化过程中的具体作用机制,便于更深入、系统地研究和了解成骨分化复杂的信号通路网络。采用CXCR4拮抗剂AMD3100抑制SDF-1和CXCR4的结合,为进一步研究细胞成骨分化调控过程中SDF-1/CXCR4信号通路抑制剂的作用机制提供新思路。方法:本研究拟采用小鼠颅顶前骨细胞系——MC3T3-E1亚克隆14,观察CXCR4拮抗剂AMD3100对地塞米松(dexamethasone, DEX)、抗坏血酸(L-ascorbic acid, AA)和β-磷酸甘油(β-glycerophosphate, β-GP)诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。本研究拟采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测的方法检测矿化前后ALP活性变化,采用茜素红染色法观察矿化结节的形成,并应用荧光定量PCR的方法检测矿化标志蛋白ALP、Runx2/cbfal、ANK、OCN等基因的表达,以及采用Western Blot的方法检测SDF-1/CXCR4通路下游蛋白STAT3和Phospho-STAT3的表达,用上述方法证实MC3T3-E1细胞矿化过程以及AMD3100抑制剂对矿化的影响情况。本实验通过观察细胞各时相成骨分化的变化,研究SDF-1/CXCR4通路及其下游蛋白STAT3在成骨分化过程中所发挥的作用。结果:(1)ALP活性检测实验结果表明,采用地塞米松、抗坏血酸及β-磷酸甘油诱导的MC3T3-E1细胞在经CXCR4特异性抑制剂AMD3100处理之后,在细胞成骨分化的第3、6、9天,与正常对照组相比,矿化组ALP活性整体呈升高的趋势,且在第6天出现ALP活性峰值;相应的抑制剂组ALP活性均呈降低趋势,且在成骨分化第6天不同浓度的抑制剂组出现AMD3100剂量依赖趋势。(2)茜素红染色实验发现,MC3T3-E1细胞在地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油介导的矿化诱导14、21天之后已能表达成骨细胞表型。但是50μM及100μM的两组抑制剂组均未见有统计学意义的茜素红染色程度的减弱。(3)荧光定量PCR的结果表明,在MC3T3-E1细胞矿化诱导第6、9天,细胞成骨分化早期标志性基因ALP、Runx2以及末期标志性基因ANK、OCN的表达在地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油介导的矿化诱导作用下均出现上调趋势,相比于矿化组,在AMD3100作用下,抑制剂组均出现相应的下调趋势。(4)Western Blot结果表明,在MC3T3-E1细胞矿化诱导第6天,在地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油介导的矿化诱导作用下Phospho-STAT3表达量升高,而在AMD3100作用下Phospho-STAT3表达量出现明显下调趋势。结论:本研究表明CXCR4抑制剂AMD3100对MC3T3-E1细胞成骨分化起到一定的调节作用,AMD3100在细胞成骨分化早期下调ALP活性,但在晚期并不能抑制MC3T3-E1细胞的基质矿化,这也可能与SDF-1/CXCR4信号通路在细胞分化前期发挥作用有关。细胞成骨分化早期标志性基因ALP、Runx2以及末期标志性基因ANK、OCN的mRNA表达在AMD3100的作用下出现下调,并且AMD3100在成骨分化早期抑制STAT3的磷酸化,这似乎提示SDF-1/CXCR4通路在成骨分化早期通过STAT3蛋白磷酸化发挥部分调控作用。